摘要：双光子成像已经成为神经电路光学监测的一种有用的工具，但它需要较高的激光功率和对样本中每个像素的串行扫描。这导致成像速率慢，限制了对神经元活动等快速信号的测量。为了提高双光子成像的速度和信噪比，我们对双光子显微镜进行了简单的改进，使用了一个衍射光学元件(DOE)，它将激光束分成几个小束，可以同时扫描样品。我们通过增强新皮层大脑切片神经元动作电位双光子钙成像的速度和灵敏度，证明了DOE扫描的优势。DOE扫描可以很容易地提高双光子和其他非线性显微技术对时变信号的检测。
双光子衍射光学元件成像
摘要：双光子成像已经成为神经电路光学监测的一种有用的工具，但它需要较高的激光功率和对样本中每个像素的串行扫描。这导致成像速率慢，限制了对神经元活动等快速信号的测量。为了提高双光子成像的速度和信噪比，我们对双光子显微镜进行了简单的改进，使用了一个衍射光学元件(DOE)，它将激光束分成几个小束，可以同时扫描样品。我们通过增强新皮层大脑切片神经元动作电位双光子钙成像的速度和灵敏度，证明了DOE扫描的优势。DOE扫描可以很容易地提高双光子和其他非线性显微技术对时变信号的检测。
我们将一个DOE放置在与物镜和检镜后孔径共轭的平面上(图1A)。这个元件在光程中被望远镜跟随，这是确保从DOE出现的小束也在检镜处重新连接在一起所必需的，允许每个单独的小束保持准直，并微调-小束传播的角度。当使用偶数量的波束时，我们通过机械阻塞消除了零级波束。虽然从DOE发射出的每个小束都与射入DOE上的激光束的直径相同，但随后的望远镜产生了一个副作用，即每个小束的大小与望远镜的功率成正比。因此，我们用另一台望远镜预先缩小或预先扩大入射激光。由于我们的系统已经在光路的早期使用了望远镜，使光束通过针孔(一个空间滤波器，确保光束截面轮廓的圆度;图1B，元素3)，我们利用同样的望远镜，通过简单地改变该望远镜的焦距和第二个透镜的位置来预补偿光束的大小(图1A)。这确保了小波束稍微覆盖了我们目标的后光圈。小束撞击到检镜上并被反射的角度决定了小束在样品上的空间扩散，这是我们实验中的一个关键变量。这个角度由来自DOE的光束间角(由其相位掩模定义)和DOE与振镜之间的望远镜功率控制。
在所有的实验中，我们都使用了DOEs，它在一条单线上创建了一系列均匀间隔的波束。这个DOE很容易绕着光路的轴线旋转，从而沿着任意方向形成一条点线。在快速扫描中，这种旋转可用于调节沿垂直维度的有效波束间角距离。为了增加每像素的光子通量，我们使用了一个五束小束DOE [SLH-505X-(0.23)-(780)来自StockerYale]，并将小束水平放置以激发相同的点，或彼此非常接近的点(图2，顶部)。
在所有使用DOE的实验中，我们确保每个小束都有足够的功率，能够充分激发荧光团。在比较单束和五束成像模式的实验中，我们将DOE保留在原位，并在两种实验中生成5个小波束，唯一的区别是在单束实验中，我们简单地在中间成像平面放置一个简单的虹膜隔膜，作为四个小波束路径上的屏障，只允许一个通过)。在这些条件下，在800 nm处，单个中心光束对样品的功率为24 mW，而所有五束光的功率之和对样品的功率为108 mW，其他四束的平均功率为21 mW，每个都在平均值的5%以内。
检镜扫描与单光束双光子光栅扫描成像相同，并使用放大光电倍增管(PMT)进行检测(PMT: H7422-P40 Hamamatsu, Bridgewater, NJ, USA;放大器:信号恢复AMETEK先进测量技术，沃金厄姆，英国)。PMT从来自DOE的多个小束同时激发的所有点收集发射光。在这种激励-促进机制下，波束的水平方向并不是严格要求的。相对于感兴趣的特征，小的波束间距是关键，然而水平方向是最直接的应用。这种成像方式稍微降低了沿小波束方向的成像的空间分辨率，但随着时间的推移增加了每个成像像素的集成强度，因为每个像素都被采样了多次，每个小波束一次。可以通过旋转DOE来改变波束的水平或垂直方向，以保持沿某一特定轴的最大分辨率，同时牺牲沿另一轴的分辨率来获得增加的信号。
我们探索了DOE在双光子成像中的应用，总体目标是提高测量的速度和信噪比。我们利用双光子成像通常只使用激光产生的一小部分功率来创建多个具有足够双光子激发的功率的光束，以便更快地激发一个完整的成像场并产生更好的信噪比。我们的系统是从双光子显微镜的早期版本发展而来的，在该系统中，我们使用DOE将激光束多重化，将谷氨酸释放到样品上(Nikolenko等人，2007年)。我们的装置包括一个定制的双光子扫描显微镜，飞秒激光作为激发源，一个传统的振镜扫描系统，一个PMT或ccd相机作为探测器(见“材料和方法”部分;我们测试了几种线性DOEs，创建了5、11、16和32个波束的线性阵列，并探索了两种通用的扫描策略，将波束水平或垂直定位，尽管我们也探索了中间位置，如下所示(图2)。实际的扫描扫描总是水平方向，每个波束都有足够的功率诱导样品的双光子激发，如果用作单个激发源，其本身将允许高质量的成像。在水平DOE模式下，在获取单个帧的过程中，用几个小波束激励每个像素，从而有效地增加每个像素的双光子激励量，随着时间的推移而集成(图2，顶部面板，“激励增强”)。这样做的一个后果是由于空间上更大的激励谱线，图像在水平方向上的空间模糊，尽管这可以最小化，空间分辨率提高，用更窄的波束间距。在垂直DOE模式下，可以扫描均匀间隔的一系列波束，这些波束均匀分布在视场的垂直维度上(图2，底部面板，“加速”;参见“材料和方法”部分)。因此,在一个系统的n光束,每个光束必须只盖一条领土的全部水平方面的高度等于1 / n总高度存在误伤的观点,从而减少所需的总时间扫描等于n倍。尽管可以使用PMT或相机在水平能源部模式,垂直能源部模式需要一个相机或其他探测器有能力解决一些光源的数量大于等于光束能量来使用。
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