本文简单介绍了双光子显微镜的技术背景，以及纯相位液晶空间光调制器在双光子显微镜进行体积成像时提升成像的扫描速度和成像质量的优势。美国Meadowlark Optics公司专注于模拟寻找纯相位空间光调制器的生产设计，我们也简单介绍了对于双光子应用中Meadowlark公司SLM非常适合的性能特点，如高刷新率、高相位稳定性、高损伤阈值等。
1436Hz纯相位空间光调制器在双光子/钙离子成像中的应用
一、引言
双光子成像是利用双光子吸收的一种成像技术，双光子吸收是指原子或分子在时间和空间上同时吸收两个光子而跃迁到高能级的现象。因此反应概率远小于一般的单光子吸收，它的几率正比于光强度的平方。神经元钙成像（calcium imaging）技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针（钙离子指示剂，calcium indicator），将神经元当中的钙离子浓度通过双光子吸收激发的荧光强度表征出来，从而达到检测神经元活动的目的。
美国Meadowlark Optics公司专注于模拟寻找纯相位空间光调制器的设计、开发和制造，有40多年的历史，该公司空间光调制器产品广泛应用于自适应光学，散射或浑浊介质中的成像，双光子/三光子显微成像，光遗传学，全息光镊(HOT)，脉冲整形，光学加密，量子计算，光通信，湍流模拟等领域。其最新推出的HSP1K（1024x1024）SLM系列的高刷新速度、高损伤阈值、大通光孔面的特性十分适用于双光子/多光子/钙离子成像这一领域。
图1. Meadowlark 最新推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM
二、双光子/钙离子成像技术介绍
双光子激发显微镜（Two-photon excitation microscopy）是一种荧光成像技术，可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。它不同于传统的荧光显微镜，其中激发波长短于发射波长，因为两个激发光子的波长长于所得发射光的波长。双光子激发显微通常使用近红外（1064nm）激发光，可以激发荧光染料。使用近红外的好处是可最大限度地减少组织中的散射。由于多光子吸收，同时能够减小背景噪声。这两种效果都会导致这些显微镜的穿透深度增加。
基于荧光指示剂的钙成像提供了一种监测动作电位的光学方法，并被系统的用于补充微电极记录，测量体内的神经元活动。这种方法为重建小型模式生物体整个大脑中的神经元群的活动开辟了道路。钙成像技术结合双光子显微镜使得在体内测量深层神经元群体的活动成为可能。随着荧光显微镜技术的迅速发展，纯相位液晶空间光调制器在体钙成像技术的应用也得到了蓬勃发展。
图2. 小鼠肠切片上的双光子激发显微镜图片。 红色：肌动蛋白。 绿色：细胞核。 蓝色：杯状细胞粘液。 通过钛-蓝宝石激光器在波长780 nm处激发获得
三、LCoS-SLM在双光子/钙离子成像中的应用
在经典的双光子扫描显微镜中，飞秒激光束被聚焦到一个衍射有限的光点，并在样品上扫描。发出的荧光被一个光电倍增管接受，其时间信号被映射到相应的像素上，最终形成图像。由于样品被激发，信号是被逐点采集的，这种方法克服了散射组织的广域成像中像素交叉干扰。由于双光子显微镜具有更高的光收集效率、更深的穿透力和更低的光毒性，通常是共焦显微镜的良好替代方案。
但双光子显微镜或任何激光扫描显微镜的致命弱点是它缓慢的速度，因为样品是按顺序逐点扫描成像的，这将是对更大的神经元回路活动进行成像的一个基本障碍。有各种扫描方法可用于改善速度，比如XY扫描振镜 (< 10 fps) 或者是共振扫描器 (> 30 fps) 以及Z轴扫描的压电控制物镜。
对于高速的3D体积成像，使用SLM液晶空间光调制器可以将光束分割成不同的目标神经元，同时可激发多个3D位点的神经元，实现多焦点在不同平面中同时快速切换，比如使用Meadowlark的1024x1024空间光调制器可以在近红外波段切换速度可以达到数百赫兹，在可见光波长实现1K Hz的帧率。同时也可用于实现光束复用和自适应光学，产生与散射组织或者光学元件共轭的波前，从而减少来自光学器件和样品的光束畸变。
图3. Meadowlark纯相位液晶空间光调制器生成的11x11点阵图
图4. 使用SLM生成贝塞尔光束
图5. Lu, R., Sun, W., Liang, Y., Kerlin, A., Bierfeld, J., Seelig, J. D., ... & Koyama, M. (2017). Video-rate volumetric unctional imaging of the brain at synaptic resolution. Nature neuroscience, 20(4), 620
四、双光子应用对液晶空间光调制器的要求
1. 高液晶响应速度 （<1ms），高刷新速度 （1436Hz）
Meadowlark公司 最新推出的高刷新频率LCoS SLM非常适用于双光子成像，这也是目前市面上能够提供最快刷新帧率的商用液晶空间光调制器。它能实现在1064nm大于294.1Hz的纯相位调制，将相位不稳定性抑制到前所未有的0.2-1.0%。Meadowlark在设计1024 x 1024硅背板时非常谨慎，以实现高速运行，同时最大程度地提高相位稳定性。1024 x 1024 SLM的速度令人难以置信，在典型的室温环境中运行时，液晶响应时间为0.9至8毫秒（取决于波长），可实现全波调制。
2. 大通光面，可承受更高的激光功率（17.40 x 17.40 mm）
对于光遗传学，许多研究人员适用飞秒脉冲激光器，这需要SLM能够承受GW/mm2的峰值功率密度。Meadowlark 在900-1100nm 可以提供镀介质镜版本的SLM，这大大增加了SLM的损伤阈值，使得能承受更大的激光功率，并得到更好的荧光激发强度。
3. 高衍射效率（Up to 98%）
Meadowlark将分辨率做到了1024x1024像素，对于光遗传学来说，这可以将入射光分为多个焦点，并对不同深度进行聚焦成像。1024×1024 空间光调制器可以提供普通版本（97.2%填充因子）和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。镀介电膜版本的SLM反射率可以做到100%，一级衍射效率可以做到98%。
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您可以通过我们昊量光电的官方网站www.auniontech.com了解更多的产品信息，或直接来电咨询4006-888-532，我们将竭诚为您服务。
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