本文围绕转盘共聚焦在高分辨率、深层成像和弱信号处理中的应用需求，介绍单分子定位显微术、ISM、双光子、深度学习和组合成像等补充方案及其适用场景，帮助读者理解转盘共聚焦如何在不同技术路线的支持下拓展能力边界。
本文围绕转盘共聚焦在高分辨率、深层成像和弱信号处理中的应用需求，介绍单分子定位显微术、ISM、双光子、深度学习和组合成像等补充方案及其适用场景，帮助读者理解转盘共聚焦如何在不同技术路线的支持下拓展能力边界。
本文将围绕这些问题展开：当目标是更高分辨率时，可以借助单分子定位显微术和 ISM 重建；当样品更厚时，可以引入双光子激发；当信号更弱或采集受限时，可以借助深度学习改善图像质量；而在复杂活细胞体系中，这些技术又会进一步组合，推动转盘共聚焦从高速成像工具走向综合成像平台。
如果想看清楚细胞内的精细结构，较直接的途径就是超越200nm的光学衍射极限，进行超分辨成像。单分子定位显微术（SMLM）是其中的重要代表，包括 PALM（光激活定位显微术）、STORM（随机光学重建显微术） 和 DNA-PAINT（DNA 点积累显微术） 等技术。它们的共同思路不是一次性把所有荧光分子都点亮，而是让信号一批一批、稀疏地出现。这样，每一帧图像中只有少量彼此分开的亮点，研究人员就可以像给星星定位一样，计算出每个亮点中心的精确位置。经过成千上万帧的采集和定位，再把这些位置叠加起来，就能重建出一幅分辨率远超传统显微镜的细胞精细结构图像。
不同方法实现“稀疏发光”的方式并不完全一样。PALM 通常利用光激活荧光蛋白，让分子分批被点亮；STORM 多依赖荧光染料在亮暗状态之间随机切换；DNA-PAINT 则更像是“临时贴标签”：带荧光的短 DNA 链会反复与目标结构上的互补 DNA 链结合和解离，每一次短暂结合都会产生一个可定位的亮点。由于荧光探针不断更新，DNA-PAINT 在长时间成像和降低漂白影响方面具有优势。
图1三维SMLM光路示意图。（a）相差法；（b）双螺旋PSF法；（c）平面法；（d）干涉法。
论文链接：DOI：10.3788/AOSOL250562
2017年，Schueder等人在《Nature Communications》发表研究，首次将转盘共聚焦（Spinning Disk Confocal，SDC）显微镜与DNA-PAINT相结合，在标准商用共聚焦硬件上实现了全细胞厚度的3D超分辨成像，横向分辨率达到~20 nm，轴向分辨率~80 nm，成像深度~10 μm，证明了该技术路线的可行性。
图2 使用SDC进行 DNA-PAINT，横向分辨率低于 15 纳米，轴向分辨率低于 50 纳米。（a）不同照明与探测方案。全内反射荧光（TIRF）会在样品表面产生倏逝场。高倾斜薄光片照明（HILO）可生成片状照明光，适用于更深层样品成像。SDC仅采集焦平面发出的红色荧光信号；（b）SDC 示意图，探测光路中引入柱透镜，利用光学像散效应实现三维超定位；（c）利用 SDC 上的 DNA‑PAINT 技术对 DNA 折纸结构成像；（d）SDC–DNA-PAINT 允许低于 20 nm 的分辨率。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-017-02028-8
在此基础上，2025 年 Zaza 等人进一步将 DNA-PAINT 与搭载光学光子重分配系统（super-resolution by optical photon reassignment，SoRa）的转盘共聚焦显微镜结合，实现了完整细胞和组织中的超分辨成像。该系统利用微透镜阵列提高光子利用效率，在 53 × 53 μm² 视野中可分辨 10 nm 甚至 6 nm 间距的 DNA docking strands；在 U2OS 细胞中，可分辨核孔复合体中相距约 12 nm 的 Nup96 蛋白对，并在 9 μm 成像深度下仍保持小于 10 nm 的定位精度。研究还在果蝇眼上皮组织中观察到黏附连接中 E-钙粘蛋白的非均匀分布，并定量分析分泌囊泡中胶原蛋白 IV 分子数量。这一工作说明，转盘共聚焦结合光子重分配后，可以进一步推动 DNA-PAINT 从单细胞薄样品走向完整细胞和组织样品中的高分辨观察。
图3 在 SDC-OPR 显微镜上对 DNA 折纸结构进行 DNA-PAINT 成像。（a）SDC-OPR系统原理图；（b）DNA 折纸设计；（c）SDC模式DNA-PAINT图像及间距测量；（d）SDC-OPR模式DNA-PAINT图像及间距测量；（e）6 nm间距DNA折纸的分辨率测试；（f）三种视野下的定位精度比较。
https://doi.org/10.1038/s41467-025-60263-w
三.图像扫描重建：ISM 让原有信息再利用
和单分子定位不同，图像扫描显微镜（Image Scanning Microscopy，ISM）并不是逐个定位荧光分子，而是对共聚焦扫描过程中已经采集到的信息进行像素重分配和图像重建。它把原本分散在不同扫描位置中的信号重新组织起来，从而提高图像细节和对比度，因此很适合用来提升已有转盘共聚焦系统的成像能力。
2020 年 Qin 等人在《Nature Protocols》发表研究，将 ISM 引入共聚焦转盘（confocal spinning-disk microscopy，CSD）显微镜，通过频闪照明、FPGA 同步控制以及 Micro-Manager 软件重建，把不同转盘角度下采集到的针孔阵列图像重新定位和累加，构建出更高分辨率的 ISM 图像。该方法在不改动显微镜和转盘主体光路的情况下，使分辨率理论上提升约 √2 倍，结合去卷积后可接近 2 倍，同时图像对比度约提高 4 倍，并在微珠、分辨率标准样品和多色细胞成像中得到验证。这一工作的意义在于，ISM 可以通过“再利用”原有扫描信息，让已有转盘共聚焦系统在不大幅改造硬件的情况下获得分辨率提升，为活细胞和三维成像提供了一条更易集成的升级路径。
图4 CSD显微镜的工作原理
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-020-00408-x
2020 年的 CSD-ISM 主要解决已有转盘共聚焦系统如何低成本提升分辨率的问题，而后续研究进一步把 ISM 推向厚组织成像中的背景抑制和高保真重建。
2025 年 Liang 等人在《Light: Science & Applications》发表研究，提出了 confocal² spinning-disk image scanning microscopy（C²SD-ISM）系统，其中 C² 指“双共聚焦”：一层来自转盘共聚焦对离焦背景的物理抑制，第二层来自 DMD 稀疏多焦点照明与动态针孔阵列像素重分配算法（Dynamic pinhole Array Pixel Reassignment ，DPA-PR）形成的重建筛选。该系统将转盘共聚焦的光学切片能力、DMD 可编程照明和 DPA-PR 算法结合起来，与单纯依赖算法去除离焦背景不同，它先在光学层面压制散射和离焦信号，再通过 DPA-PR 校正 Stokes 位移、像差和系统非理想因素，实现更稳定的 ISM 超分辨重建。该系统实现了 144 nm 横向分辨率和 351 nm 轴向分辨率，在组织中成像深度可达 180 μm，重建图像与原始共聚焦图像的线性相关性可达 92%，并在小鼠肾脏组织、斑马鱼血管等样品中验证了深层组织超分辨成像能力。
这一研究进一步拓展了转盘共聚焦 ISM 的应用边界，使其更适合厚组织和复杂生物样品的高保真观察。
图5 C2SD-ISM 系统的光学设计与成像性能评估。（a）C2SD-ISM 的光学配置；（b）出射角β、波长λ、入射角α之间的定量关系；（c）衍射效率η、波长λ和入射角α之间的定量关系；（d）不同N值下针孔在同心螺旋上的分布及视场覆盖示意图；（e）不同N值的阿基米德螺线叠加比较；（f）SD 对不同样品厚度和不同 DMD 掩模的成像可见度的影响；（g）DMD多焦点照明在有/无SD下的小鼠肾脏切片成像对比；（h）沿（g）中虚线位置的归一化荧光强度分布曲线；（i）有/无SD时荧光强度局部对比度的箱线图比较。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41377-025-01930-x
当样品变厚，问题就不只是分辨率了，还包括散射、背景和光损伤。双光子激发指的是荧光分子在焦点附近同时吸收两个近红外光子后被激发，因此激发主要局限在焦点区域，能减少离焦信号干扰，更适合厚组织、胚胎和活体样品。与转盘共聚焦结合后，它可以在保持较低光损伤的同时，提高三维样品的成像效率，尤其适合长时程活体观察。
2022年，Kamada等人在《Scientific Reports》上发表研究，利用“双光子激发转盘共聚焦显微镜（two-photon excitation laser scanning microscopy using a spinning-disk scanner，TPLSM-SD）”，在激发端引入两路近红外脉冲激光的快速切换，用不同波长服务于多色荧光标记；在探测端加入图像分光系统，把发射荧光按波长范围分到不同通道；随后在图像处理阶段使用线性解混算法，把不同通道中相互串扰的荧光信号重新分离出来。该系统实现了 x、y、z、时间和颜色维度上的低侵入 5D 成像，可对正在分裂的 HeLa 细胞和烟草 BY-2 细胞进行三维多色长时程观察，清楚追踪染色体、微管、肌动蛋白、着丝粒等结构在有丝分裂过程中的动态变化。结果显示，相比单光子转盘共聚焦，双光子方案对细胞分裂进程的干扰更小，说明 TPLSM-SD 更适合用于活细胞中多色、三维、长时程动态过程的低侵入观察。
图6（A）TPLSM-SD光路示意图，系统可在两路激光间切换，并搭配分光成像光路；（B）该系统在 920 nm 与 1040 nm 两种激发波长下的色差表征结果。左图：尼罗红标记的 1μm微球三维荧光融合图像；右图：沿轴向的荧光强度分布曲线。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41598-021-04543-7
除了活细胞中的长时程动态观察，双光子与转盘共聚焦的组合思路也开始被用于更复杂的病理组织微环境研究中。
2025年，Estaun-Panzano等人在《Advanced Science》上发表研究，利用双光子 shadow imaging 与转盘共聚焦量子点单颗粒追踪技术，对阿尔茨海默病模型小鼠皮层斑块周围的细胞外空间进行了纳米尺度分析。研究揭示了斑块内外扩散行为的异质性和细胞外基质改变，为理解病理组织中的物质扩散、斑块可穿透性及药物递送提供了重要成像依据。该研究中，Oxxius L4Cc 多波长合束激光器提供了关键激发光源：405 nm 通道用于激发淀粉样斑块自发荧光，以识别斑块区域，并结合 IBA-1、GFAP+S100 和 HABP 等多通道标记观察到斑块周围胶质细胞聚集与细胞外基质破坏（如图7所示）；488 nm 通道则用于激发量子点探针，进一步进行动态追踪。这一案例充分说明，L4Cc凭借一机集成多波长、独立调制、高功率稳定的性能，能够灵活支持转盘共聚焦在深层组织识别、弱信号激发和动态追踪中的多样化应用需求。
图7 APP/PS1小鼠皮层淀粉样斑块多通道成像。 405 nm自发荧光（蓝）标记斑块；GFAP+S100标记星形胶质细胞；IBA-1标记小胶质细胞；HABP标记透明质酸。
论文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202515674
上海昊量光电设备有限公司代理美国OXXIUS公司的MixxWave系列多波长合束激光器，该产品具有以下特点，非常契合转盘共聚焦的应用。
Oxxius MixxWave 单频激光合束器可将多路窄线宽激光光源合并为一路精确准直的输出，光谱线宽低至 1 MHz，波长范围覆盖 473–1064 nm。该产品提供两种配置：L4Cc（多达集成 4 路激光）和 L6Cc（多达集成 6 路激光）。它面向对相干性要求较高的应用而设计，例如精密光谱、干涉测量和布里渊测量等，在这些应用中，光束纯度和光谱稳定性至关重要。
应用一览：拉曼光谱 、荧光显微镜 、光遗传学、 微流控 、细胞计数 、光片显微镜、 FRAP / TIRF 、全息光刻 、半导体检测。
1.多波长合束，简化：MixxWave 将多个激光波长组合成一个精确对齐的单一光束，并在自由空间或通过一根或多根光纤传输。
具有两个输出的 L6Cc 组合器的示例配置
2.设计稳定，易于维护：MixxWave 的稳定性建立在经过验证的光学布局之上，具有短光束路径和 Oxxius 光源的超低热负载。光学组件易于访问，使维护更简单并支持未来升级。
集成紧凑且易于维护
3.MixxWave不仅提供多波长合束输出，还支持光纤耦合、单通道独立调制、TTL 同步控制、主动散热及多种扩展模块，便于与转盘共聚焦系统集成，满足多色成像、动态追踪和弱信号激发等应用需求。
在弱信号场景下，真正难的往往不是有没有图，而是图像够不够干净。SDC虽然成像速度快，但在三维成像中，如果为了提高信噪比和分辨率而反复采集，就会增加光漂白、光毒性和计算负担。深度学习的价值正在于此：它不替代硬件，而是在已有图像的基础上进行去噪、去模糊和细节恢复，让较少采集得到的数据也能呈现出更清楚的结构信息。
中国科学院西安光学精密机械研究所的 Bai 等人在《IEEE Photonics Technology Letters》发表研究，提出了 SRRF-Deep 方法。该方法先用普通转盘共聚焦图像堆栈和对应的 SRRF 高质量图像进行训练，再利用相邻 Z 层之间的上下文信息，从单次扫描得到的三维图像中直接恢复出接近 SRRF 效果的高质量结果。研究显示，该方法在雏菊花粉、曲霉分生孢子、洋葱花粉、小鼠肠道切片和百合花粉多通道成像中均改善了图像清晰度和对比度；相比传统 SRRF，所需图像数量减少约 100 倍，重建速度提高约 30 倍。这项研究说明，深度学习可以把转盘共聚焦的“少采集、快成像”优势进一步转化为更清晰的三维图像，为弱信号样品和多通道成像提供了更高效的图像恢复路径。
图8 (a) SDCM 成像系统原理图；(b) SRRF-Deep 使用一张 SDCM 图像栈及其对应的 SRRF 参考图像进行训练，从而充分利用 z 轴扫描中相邻像素间的上下文信息；(c) 利用训练好的网络重建出高质量的输出图像。
论文链接：DOI：10.1109/LPT.2020.3014317
从前面几类研究可以看出，转盘共聚焦的改进已经不再局限于某一个单点指标。SMLM、ISM、双光子和深度学习分别从分辨率、信息重建、深层成像和图像恢复等方向扩展了它的能力，而真正面向复杂活细胞体系时，这些思路往往会进一步组合起来，服务于快速、多通道、低光毒的动态观察。
2025 年 Zhanghao 等人在《Nature Communications》发表研究，正体现了这种组合化趋势。他们针对活细胞中多种细胞器难以同时观察的问题，将扩展分辨率转盘共聚焦、脂质敏感染料 Nile Red、比率成像和深度卷积神经网络结合起来，用尽可能少的标记和激发通道实现多细胞器成像与分割。系统通过超分辨成像（LiveSR）模块进行光学像素重分配，将转盘共聚焦的分辨率提升到约 143 nm；随后利用 Nile Red 在不同膜环境中发射特性的差异，配合深度学习从同一组图像中分割出多达 15 种亚细胞结构。研究还通过迁移学习适配不同显微镜、不同细胞类型和活组织样品，并用于追踪内质网、线粒体、溶酶体、脂滴、高尔基体和微管等结构之间的快速动态互作。这项研究说明，转盘共聚焦正在从单一的高速三维成像工具，发展为融合光学增强、染料策略和 AI 分析的组合式平台，为解析活细胞中的细胞器网络提供了新的思路。
图9（a）转盘共聚焦-LiveSR 多通道成像系统；（b）用 100 nm荧光珠测三维点扩散函数来标定分辨率。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-57877-5
转盘共聚焦的价值，不只在于“拍得快”，更在于它有很强的可扩展性。面对更复杂的成像需求，转盘共聚焦的发展并没有停留在“高速扫描”本身，而是不断通过光学设计、图像重建和智能分析拓展能力，逐步走向更高分辨率、更深层样品和更多维信息的综合成像平台。在激发光源层面，Oxxius MixxWave 系列多波长合束激光器可提供灵活的波长组合、独立通道控制和快速调制能力，为转盘共聚焦在多色成像、弱信号激发和长时程活细胞观察中的稳定运行提供了重要支撑。
未来，随着光学、算法、标记策略和光源技术进一步融合，转盘共聚焦有望在活细胞、厚组织和小型模式动物成像中发挥更大作用。成熟技术并不等于停滞；只要平台足够开放，仍然可以不断延伸出新的能力。
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Gao Zihan, 高. et al. 三维超分辨显微成像技术及研究进展（特邀）. Acta Optica Sinica (Online) 3 (2026).
Schueder, F. et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun 8, 2090 (2017).
Zaza, C. et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun 16, 4991 (2025).
Qin, S., Isbaner, S., Gregor, I. & Enderlein, J. Doubling the resolution of a confocal spinning-disk microscope using image scanning microscopy. Nat Protoc 16, 164–181 (2021).
Liang, Q. et al. High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal(2) spinning-disk image scanning microscopy. Light Sci Appl 14, 260 (2025).
Kamada, T. et al. Low-invasive 5D visualization of mitotic progression by two-photon excitation spinning-disk confocal microscopy. Sci Rep 12, 809 (2022).
Bai, C. et al. 3D Imaging Restoration of Spinning-Disk Confocal Microscopy Via Deep Learning. IEEE Photonics Technology Letters 32, 1131–1134 (2020).
J. Estaún-Panzano, Y. Dembitskaya, I. Calaresu, et al. “ Nanoscopic Mapping of the Extracellular Space in Amyloid Plaque-rich Cortex.” Adv. Sci. 13, no. 1 (2026): e15674.
Zhanghao, K. et al. Fast segmentation and multiplexing imaging of organelles in live cells. Nat Commun 16, 2769 (2025).
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