别被显微镜下那张安静的细胞照片骗了。真实的细胞内部，其实热闹得像一场高速运转的微观电影：线粒体在分裂、融合，囊泡在细胞里来回穿梭，钙信号可能几秒内就完成一次爆发。问题是，细胞跑得这么快，显微镜真的追得上吗？传统宽场显微镜拍得快，但画面容易被焦外背景“糊”住；激光扫描共聚焦看得清，却要一个点一个点慢慢扫，遇到活细胞成像中快速的细胞动态过程就可能慢半拍。于是，转盘共聚焦显微镜登场了。它的思路很巧妙：既然一个光点扫描太慢，那就让很多光点一起扫描。这样，显微镜不仅能保留共聚焦的清晰度，还能用更快的时间分辨率和更温和的方式（低光毒性）捕捉活细胞中的瞬间变化。本文，我们就从宽视场荧光显微镜、点扫描共聚焦讲起，看看转盘共聚焦是如何一步步发展出来，又是怎样让显微镜追上细胞速度的。
细胞跑太快，显微镜怎么追上它？转盘共聚焦的前世今生
别被显微镜下那张安静的细胞照片骗了。真实的细胞内部，其实热闹得像一场高速运转的微观电影：线粒体在分裂、融合，囊泡在细胞里来回穿梭，钙信号可能几秒内就完成一次爆发。问题是，细胞跑得这么快，显微镜真的追得上吗？
传统宽场显微镜拍得快，但画面容易被焦外背景“糊”住；激光扫描共聚焦看得清，却要一个点一个点慢慢扫，遇到活细胞成像中快速的细胞动态过程就可能慢半拍。于是，转盘共聚焦显微镜登场了。它的思路很巧妙：既然一个光点扫描太慢，那就让很多光点一起扫描。这样，显微镜不仅能保留共聚焦的清晰度，还能用更快的时间分辨率和更温和的方式（低光毒性）捕捉活细胞中的瞬间变化。
本文，我们就从宽视场荧光显微镜、点扫描共聚焦讲起，看看转盘共聚焦是如何一步步发展出来，又是怎样让显微镜追上细胞速度的。
在活细胞成像研究中，真正关键的信息常常藏在时间里：一个细胞器什么时候移动、两个结构什么时候接触、一个信号什么时候出现又消退。显微镜不仅要有空间分辨率，能看清细节；还要有时间分辨率，能追上变化。这正是转盘共聚焦显微镜所要解决的核心问题。
图1 HBmito Crimson 标记活细胞线粒体的转盘共聚焦延时成像。在保持低光毒性的前提下，以高时间分辨率清晰记录线粒体持续的分裂与融合过程（双击可播放视频）[1]。
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宽视场荧光显微镜一次照亮整个视野，成像速度取决于相机的采集帧率，可以非常快。但它照亮的是整个样品——焦平面上下的荧光信号一起进入相机，图像里混入大量焦外背景。样品越厚，干扰越明显，如图2所示。想看的结构还在，但周围像蒙了一层雾。
图2 宽场荧光显微成像原理及厚样品成像效果[2]。
如果说宽场显微镜的问题是“看得快，但背景杂”，那么点扫描共聚焦显微镜解决的就是“怎样只看清焦平面”。
1957 年，马文•明斯基（Marvin Minsky）搭建了一台共聚焦显微镜。它较关键的设计，是在光路中加入一个小小的针孔。这个针孔像一道“筛子”：只允许来自焦平面附近的荧光通过，把焦平面上下的焦外信号挡在外面。正因为有了这一步空间滤波，共聚焦显微镜才能获得更干净的图像，并实现光学切片成像。
如图3所示，激光扫描共聚焦的光路可以分为激发和检测两部分。A中，激发激光经物镜聚焦到样品上，使焦平面附近的荧光分子被激发；B中，样品发出的荧光返回检测光路，来自焦平面的信号能够穿过针孔，并被光电倍增管（PMT）检测，而来自焦外区域的荧光则会被针孔挡住，无法进入检测器。
图3 激光扫描共聚焦显微镜激发（A）与发射（B）光路原理图[2]。
论文链接:DOI: 10.7171/jbt.15-2602-003
不过，清晰度是有代价的。传统激光扫描共聚焦通常需要逐点扫描样品，像用一支手电筒在黑暗房间里一点一点照过去。每个点都要采集信号，整幅图像自然需要时间。对于固定样品来说，这个速度通常可以接受；但对于正在移动、分裂、运输物质的活细胞来说，点扫描共聚焦就可能慢半拍，难以匹配快速的细胞动态。更长的扫描时间和更集中的激光照射，也会增加光漂白和光毒性，限制活细胞的长时间观察。
点扫描共聚焦的“清晰与速度的矛盾”推动了一个新方向：与其让一个光点在样品上逐点扫描，不如让多个光点同时参与扫描。这样，扫描任务被分散到多个光点上，整幅图像的采集时间就可以大大缩短。
这个思路的源头，可以追溯到1884年德国发明家 Paul Nipkow 设计的一张带孔旋转圆盘，也就是后来被称为 Nipkow 盘的装置。小孔沿阿基米德螺旋线排列，圆盘转动时会依次扫过画面，把二维图像拆解成随时间变化的光信号，再用于图像的传输和重组。
Nipkow 盘起初并不是为显微成像设计的，也还谈不上共聚焦成像；但它提供了一个关键启发：可以利用旋转圆盘上的孔阵列，对一个视场进行快速、规律的扫描。这个早期机械扫描思路，后来成为转盘共聚焦的重要源头。
图4 Nipkow disk 的起初设计图
1967 年，David Egger 和 Mojmír Petráň 将 Nipkow 盘的多孔扫描思路引入共聚焦显微镜，搭建了早期的转盘式共聚焦显微镜[3]。其核心是在旋转圆盘上设置大量针孔，针孔沿阿基米德螺旋线排列。圆盘转动时，不同针孔依次扫过样品视场，从而把传统共聚焦的“单点扫描”变成“多点并行扫描”。如图5所示，针孔并不是随机分布，而是按照螺旋轨迹排布。这样可以让圆盘旋转时，光点更均匀地覆盖整个成像区域，并减少相邻针孔之间的串扰。图中红色位置表示转盘旋转后针孔移动到的新位置，说明多个针孔会随着转盘运动持续补充扫描区域，随后完成整幅图像的快速采集。
图5 Petráň disk 的示意图
早期单转盘共聚焦显微镜的主要限制之一是照明效率较低，其透过率仅约为 4%。为改善这一问题，韦恩州立大学的 Li Chen 及其同事提出了双转盘共聚焦显微镜。该系统由两片同步旋转的转盘组成：一片是含有约 20,000 个针孔的Nipkow盘，另一片是与针孔一一对应的微透镜盘。两片转盘共同安装在同一电机轴上，间距等于微透镜的焦距。当准直光照射微透镜阵列时，每个微透镜都会将光聚焦到对应针孔上，使约 40% 的照明光能够进入针孔，从而显著提高光利用效率。与此同时，Chen 在两片转盘之间加入偏振棱镜，用来把反射产生的杂散光从主光路中分离出去，减少它进入探测通道造成背景干扰[4]。
这项双转盘技术随后在 20 世纪 90 年代初被授权给 Yokogawa Electric Corporation，并推动了 Yokogawa Confocal scanner Unit（CSU）的商业化。Yokogawa 在开发过程中进一步认识到，随着绿色荧光蛋白（GFP）及其光谱变体的出现，共聚焦荧光显微镜正在迅速成为活细胞成像研究的重要方法。为了使 CSU 更适合荧光成像应用，系统需要在两片转盘之间加入平板二向色镜，用于分离激发光与荧光信号，并将荧光导向探测光路。
在后续的 CSU 系列系统中，例如 CSU-X1：Nipkow盘上分布着约 20,000 个针孔，微透镜盘上排列着与之对应的微透镜。成像时，并不是所有针孔同时被照亮，而是约 1,000 个光点同时落到样品上；随着转盘高速旋转，这些光点不断移动，并像一组快速扫描的光点阵列一样覆盖整个视场。
激发：激光经扩束后照射到上层微透镜盘，微透镜将激发光聚焦到下层针孔盘对应的针孔中。穿过针孔后的光经物镜聚焦到样品上，形成大量聚焦光点。随着转盘高速旋转，这些光点快速扫过整个视场。
共聚焦滤波：样品被激发后发出荧光，荧光沿返回光路再次经过针孔盘上的同一针孔。针孔可以有效阻挡来自焦平面以外的杂散光，只让焦平面信号通过，从而实现光学切片。
相机成像：通过针孔过滤后的荧光信号经二向色镜导向探测光路，进入高灵敏度相机（scmos 或 emccd）。相机在曝光时间内接收并累积这些信号，随后形成完整的共聚焦图像。
双转盘结构的核心价值在于：微透镜提高了通光量，针孔保留了共聚焦的光学切片能力，多光束并行扫描则提高了成像速度。因此，转盘共聚焦显微镜既能减少光漂白和光毒性，又能更好地适应活细胞动态成像。
图6 转盘共聚焦显微镜成像原理示意图[5]
论文链接：https://doi.org/10.1007/b102210
在双转盘结构之后，转盘共聚焦又往前走了一步，不再只追求“拍得快”，还开始追求“看得更细”。这背后的关键，是光学光子重分配技术（Optical Photon Reassignment, OPR）。简单说，显微镜收到的荧光信号，并不一定正好来自探测器上那个位置正下方的样品点。光子真正的来源，往往需要结合激发位置和检测位置一起判断。OPR 做的事，就是把这些信号重新“摆回”更接近真实发光点的位置，让图像更锐利、细节更清楚。
这个思路先在图像扫描显微镜（Image Scanning Microscopy, ISM）中以软件重分配的方式实现。ISM 会记录每个扫描位置对应的图像信息，再通过后期计算把荧光信号重新分配到更接近真实发光点的位置，从而提高分辨率。不过，这种方式通常需要较大的计算量，也会增加图像处理的复杂度。
2015年，Yokogawa团队的Azuma与Kei提出了SD-OPR（Spinning Disk Optical Photon Reassignment，转盘式光学光子重分配）技术。该技术在转盘共聚焦系统的针孔盘下方加入微透镜阵列。如图7所示，发光仍通过转盘形成多个照明光点，对样品进行快速扫描；荧光信号返回后，则先经过微透镜阵列，被压缩至约原来的1/2并重新定位，再通过针孔滤除焦外信号，末尾进入相机成像[6]。通过这种光学重分配，系统获得了类似缩小针孔的效果，从而增强焦外抑制能力、提高图像分辨率，同时保留转盘共聚焦高速成像和低光毒的优势。这一思路后来被Yokogawa商业化为SoRa系统。
研究表明，SD-OPR在单次曝光下可使横向分辨率提升约1.37倍；结合反卷积处理后，分辨能力较传统衍射极限提高约2倍。在微管样品实验中，处理后的图像还能够分辨间距约113 nm的细微结构。
图7 SoRa 超分辨转盘共聚焦成像原理示意图
因此，SoRa 可以理解为转盘共聚焦的一次“精细化升级”：普通 CSU 系列解决的是高速、低光毒、光学切片的问题；SoRa 则在这个基础上，通过光学光子重分配进一步提高分辨率。对于活细胞成像来说，这一点很重要，因为它不需要通过大幅增加激光功率来换取细节，而是在保持转盘共聚焦温和成像特点的同时，让细胞内部结构看得更清楚。
图8 (A)双盘 SDCM 的布局示意图[7]；(B)固定Nipkow盘的真实图像[7]。
论文链接：http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-420138-5.00009-4
转盘扫描头：常见单盘和双盘结构。单盘通过针孔阵列实现多点并行扫描；双盘在针孔阵列盘基础上增加微透镜阵列盘，可提高激光利用率和成像亮度。
激光源：常用 405/488/561/568/637/640/642 nm 等多线激光器，配合激光合束器和光纤耦合模块提供不同波长的激发光。常规活细胞成像多用可见光，厚样本成像可选近红光。
探测器（相机）：常用 scmos 或 EMccd。 sCMOS 速度快、视野大、分辨率高，适合大多数活细胞和高速成像；EMCCD 灵敏度更高，更适合荧光信号很弱的样品。
运动与环境控制：包括电动 XY 台、压电 Z 轴、自动对焦、活细胞培养箱、温控/CO₂ 控制和防震平台，决定长时程、三维和活细胞实验能力。
上海昊量光电设备有限公司代理法国 Oxxius 旗下 89North 的激光二极管照明器（LDI-G2）-这是 LDI 系列的第二代升级产品，在控制精度、功率稳定性和光功率输出方面实现了全面提升，突破荧光成像与活细胞成像极限。
图9 LDI-G2产品图
该产品具有以下特点，非常契合转盘共聚焦系统的应用。
图10 LDI-G2 内置主动反馈控制系统，照明稳定性高达 99.8%。
图11 LDI-G2系列产品线概述
图12 LDI-G2规格
讲完转盘共聚焦的来源和原理，再回头看它的价值，就不只是“拍得更快”这么简单。Nipkow盘带来了多点扫描的思路，双转盘微透镜结构提高了光利用率，SoRa又把光学重分配引入其中，让转盘共聚焦在速度、信号和分辨率之间不断寻找更好的平衡。这种平衡对活细胞成像尤其重要——研究者想看的往往不是某一张静态图片，而是一个正在发生的过程。转盘共聚焦的意义，就在于它尽量减少对细胞的打扰（低光毒性），同时以高时间分辨率把这些连续变化记录下来。而这一过程的实现，离不开稳定可靠的光源支持。上海昊量光电设备有限公司代理法国 Oxxius 旗下 89North 的 LDI-G2，凭借 99.8% 的稳定性和多波长输出，为转盘共聚焦提供了可靠的光源保障。
下一篇，我们将把视角转向活细胞研究，看看转盘共聚焦为什么不仅是“拍得快”，更能成为观察动态生命过程的常用工具。
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