透明生物样品的光学显微镜成像可以大体分为无标记和有标记这两类。两者都致力于产生一种对比度机制，以实现所用波长照明下透明样品结构的可视化。基于标记的成像依赖于染色剂和各种造影剂在某些感兴趣的结构处产生荧光。无标记成像是非侵入性的，以特异性为代价简化了样品制备，并避免了造影剂的任何可能的毒副作用。定量相位成像是无标记成像的一种，它依赖样品和周围介质的相位差(表现为折射率差)对透明结构成像。数字全息就是这样一种常用的无标记手段，样品的数字全息图可以在焦平面外采集，然后在后处理中通过数值求解模拟波前传播过程的衍射积分进行数字聚焦。数字全息已在生物学、诊断学和医学、微流控和片上实验室成像(lab on a chip)、三维追踪、细胞力学、即时检验(point of care testing)、环境监测等领域得到了广泛的应用。
博览：2021Light Sci Appl植物细胞的脱水推动细胞核旋转用于实现3D相衬层析成像
技术背景：
透明生物样品的光学显微镜成像可以大体分为无标记和有标记这两类。两者都致力于产生一种对比度机制，以实现所用波长照明下透明样品结构的可视化。基于标记的成像依赖于染色剂和各种造影剂在某些感兴趣的结构处产生荧光。无标记成像是非侵入性的，以特异性为代价简化了样品制备，并避免了造影剂的任何可能的毒副作用。定量相位成像是无标记成像的一种，它依赖样品和周围介质的相位差(表现为折射率差)对透明结构成像。数字全息就是这样一种常用的无标记手段，样品的数字全息图可以在焦平面外采集，然后在后处理中通过数值求解模拟波前传播过程的衍射积分进行数字聚焦。数字全息已在生物学、诊断学和医学、微流控和片上实验室成像(lab on a chip)、三维追踪、细胞力学、即时检验(point of care testing)、环境监测等领域得到了广泛的应用。
相衬层析(phase contrast tomography，PCT)可以从不同方向探测样品，从而测量出样品的三维折射率分布。多方向探测可通过移动光源、旋转样品的等方式获得样品不同方向的信息。
当前不足：
当前基于数字全息的PCT需要在机械或光电激光束扫描设备的情况下完成三维成像。
文章创新点：
基于此，意大利那不勒斯费德里克二世大学的Zhe Wang(第一作者)和Pietro Ferraro(通讯作者)等人利用植物细胞在脱水过程中会引起细胞核显著旋转的特性，结合基于数字全息的PCT，实现了无需额外扫描机制的洋葱表皮细胞核三维层析成像。
原理解析：
(1) 实验装置。如图1所示，所用为Mach-Zehnder干涉光路。激光器出光经过第一个半波片(HWP1)和偏振分光棱镜(PBS)组合，分成物参光能量比可调(通过旋转HWP1实现)的物光和参考光。参考光路有第二个半波片(HWP1),用于调整参考光的偏振方向，使得最终的干涉对比度最大。物光和参考光的光路使用相同的物镜，用于抵消物镜引入的相位畸变。最终物光和参考光经过分光棱镜(BS,非偏振敏感)合束，被相机接收。通过旋转BS以改变物光和参考光之间的夹角，以形成离轴干涉干涉光路。激光器输出功率20mW(MSL-III-532,长春新产业)，25X/0.4物镜(GCO-2114MO，大恒新纪元)。
(2) 植物细胞诱导脱水引起细胞核在一个大的范围内旋转。植物细胞有细胞壁，原生质体被细胞壁给包围着。原生质体包含了细胞膜、细胞核、细胞质和细胞器。植物细胞中一个典型的细胞器是液泡，这是一个由液泡膜包裹着储存细胞液的容器。一个成熟的植物细胞，液泡通常占据了80%到90%之间的细胞体积。通过将环境湿度降至35%，保持20℃的常温，可以使得液泡内的细胞液逐渐蒸发，液泡逐渐缩小的同时会引起细胞核的旋转，这个过程很缓慢，用于PCT观察的时间窗口为7个小时，在这段时间内不会对植物细胞造成不可逆的伤害。
(3) 旋转角估计。简单而言，将细胞核看作一个椭球体，椭球体有一个沿x轴的长轴，一个沿y方向的最大短轴，一个沿z方向的最小短轴，如图2c,d。椭球体绕x轴滚动旋转，并沿着z轴投影，长轴长度不变。短轴随着旋转角度发生变化，根据短轴的角度就可以知道旋转角度，如图2e,h。
(4) 滤波反投影法三维层析重建。滤波反投影是一种很成熟的算法，此文对于重建只是一笔带过。根据全息重建得到的相位图及其相应的旋转角，可以使用滤波反投影法获得植物细胞核的3D层析图。有一个现成的python包可以借鉴此算法，见https://neutompy-toolbox.readthedocs.io/en/latest/index.html
视频1：恢复细胞核滚动角的方法，用于3D相衬层析成像(PCT)
视频2：两个植物细胞核的3D层析重建
视频3：在红色激光下捕获的四个植物细胞核的3D层析重建
参考文献：Wang, Z., Bianco, V., Pirone, D. et al. Dehydration of plant cells shoves nuclei rotation allowing for 3D phase-contrast tomography. Light Sci Appl 10, 187 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41377-021-00626-2
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