相干拉曼显微镜系统的大部分成本和复杂性在于激光激发。必须利用两个激光波长，对绝对波长进行一定控制，并对频率差进行精确控制，使其在单个拉曼线(10 cm−1)的宽度内。
光源对相干拉曼显微镜系统性能的影响
历史上，第一个相干拉曼显微镜使用了光谱可见区域的脉冲染料激光器。最近的系统已经使用了固体激光器系统，或基于电子同步钛蓝宝石激光器或同步泵浦光学参数振荡器(opo)的锁模激光器。新一代基于光纤的系统，无论是基于光子晶体光纤或有源光纤激光器中的非线性频率转换，都承诺提高易用性和更低的成本，但目前使用这些系统需要在性能上进行权衡。
相干拉曼显微镜的激发需要(至少)两个激光波长，其中一个波长必须是可调的，以匹配分子振动频率的差频。此外已经证明，用几皮秒的激光脉冲宽度激发CARS和SRS可以理想地平衡高效生成非线性信号所需的高峰值功率与相对狭窄的光谱带宽(<1 nm)的要求，以匹配分子振动的固有线宽。对于高速成像，至少需要10 Mhz的重复频率，理想情况下应该更高。这是因为在视频速率成像中，数据是以每秒1000万像素的速度获取的，并且CARS至少需要每个像素发射一个激光(对于带有调制传输检测的SRS至少需要两个激光)。此外，近红外光谱区域的激光激发已被证明能最大限度地减少CARS中非共振背景的产生，与可见光激发相比，提供了减少的光损伤，也为非线性显微镜提供了良好的穿透组织的能力。最后，由于CARS或SRS显微镜中的光激发路径通常具有相对较低的透射率(从激光输出到样品通常观察到10%-20%)，因此需要瓦级平均功率。
许多研究小组发表的论文报道了使用50 - 200 fs脉冲宽度而不是2 - 6 ps脉冲。虽然CRS过程可能由飞秒脉冲激发，但这是以降低信号水平、限制可调谐性、损失光谱选择性和增加CARS中的非共振背景为代价的。这主要有两个原因。首先，典型的拉曼光谱特征宽度约为15 cm−1。在800nm附近，这相当于约1 nm的带宽。对于任何激光器系统，激光脉冲宽度和激光光谱带宽之间的反比关系意味着，对于给定的光谱带宽，可以达到的最短脉冲有一个基本的限制。在1 nm带宽的情况下，假设脉冲形状为高斯，该脉冲宽度约为0.95 ps。将脉冲缩短到这个值以下将导致CARS中非共振背景/共振信号比的增加，从而降低对比度和降低图像质量。
在SRS中，结果很简单，即使峰值功率(因此非线性光损伤)会增加，也不会产生额外的信号，因为与拉曼有源跃迁没有共振的频率分量不会产生信号。此外，如果附近发生两个共振，较宽的带宽将意味着光谱分辨率较低，获得的图像将受到两个共振信号的污染。对于用于多光子显微镜的商用锁模飞秒钛蓝宝石激光器获得的典型8 nm带宽，这意味着只有大约1/8的激光能量应用于样品被CRS过程有效利用。相比之下，对于几皮秒的脉冲，所有的激光强度都集中在与拉曼共振完全匹配的较窄频段，可以很好地分辨。虽然宽带飞秒激光器的光谱分辨探测可以以高分辨率恢复CARS或SRS光谱，但它通常需要ccd相机等多元素探测器，每个像素的读出时间非常长，这严重限制了成像速度。
脉冲长度稍长、平均功率较高但峰值功率降低的第二个特征是非线性光损伤降低。这实际上是有好处，通过激发6 ps脉冲比150 fs脉冲允许更多的总SRS信号，即使在广泛共振的情况下。其原因是，在许多样品中，随着激光脉冲宽度的减小，非线性光损伤比感兴趣的信号增加得更快。在使用较短脉冲的情况下，光损伤显然会比SRS的信号水平上升得更快。当然，实际的缩放和损伤阈值高度依赖于样本，因此很难对安全功率水平做出绝对的声明。
相干拉曼技术的主要优势是成像速度和灵敏度，在1-10 ps范围内(相对于100-200 fs)的激光脉冲的适当选择是获得最佳结果的关键。在这个范围内，精确的选择只会对可获得的信号产生很小的影响(小于2倍)，同时保持良好的光谱分辨率。
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