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基于拉曼散射的光学显微技术。其特点为:通过探测目标分子特定的振动来提供成像所需的衬度;通过非线性光学过程大大提高检测的灵敏度;同时具备三维成像能力。主要包含相干反斯托克斯拉曼散射和受激拉曼散射两种方法。 ...
相干拉曼显微系统的发展中遇到的新挑战尽管CRS具有非常理想的成像特性,但生物医学成像界对该技术的采用一直是一个缓慢且看似漫长的过程。CRS方法主要由一群敬业的开发人员推动,开始进入大学成像设施、神经科学实验室和临床环境。到本世纪末,CRS显微技术的商业化似乎有了足够的动力。第一个打入市场的CRS成像系统是由奥林巴斯生产的,几年后又由徕卡微系统公司生产了专用的相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜。人们希望CRS显微镜技术能够扩展到生物成像的其他领域,并且该技术能够作为生物研究的常规工具占有一席之地。尽管令人印象深刻的研究表明,CRS可以映射脂类以外的各种生物化学化合物,但该方法并没有轻易摆脱 ...
提高相干拉曼成像灵敏度的方法由于照射到样品表面的光功率受到样品损伤阈值的限制,提高CRS显微系统灵敏度的唯一可行方法就是增加分子响应器的有效拉曼截面。对于内源性化合物,拉曼截面是分子的固有性质,当激发波长远离电子共振时,拉曼截面基本上不会改变。然而,对于外部探针,当电子共振出现在激励束的频率附近时,拉曼截面可以显著提高。共振拉曼散射原理可应用到CRS系统的光激发中,达到相应提高分子浓度的检出限的作用。这一方法要求发色团表现出与电子共振良好耦合的振动模式。如受激拉曼散射系统(SRS)所示,当激发频率在电子跃迁附近调谐时,为荧光标记目的开发的荧光团显示高达倍的振动响应的出色增强。结果是这种荧光探针 ...
相干拉曼技术中光调制方案优缺点瓦级1064 nm斯托克斯激光束使用的峰值功率可以在紧聚焦时损坏声光调制器(AOMs)。但是对于高速调制,AOM需要激光聚焦入射。这是因为驱动调制的声波必须以垂直的方式穿过激光束腰。考虑到常用声光材料的声速,10 MHz调制需要的焦点光斑小于100 μm,由此产生的峰值强度过高。宽带电光调制器的使用也可能存在问题。这是因为宽带电光调制器利用高功率射频放大器与较长的电缆连接到相对笨重的调制器。这些电缆可以发射电磁干扰,使锁相放大器不堪重负。因此,电缆和放大器的小心放置和良好的屏蔽是必要的。也可以观察到“幽灵”效应,即系统的噪音水平取决于个人站在房间里的位置,因为人体 ...
相干拉曼技术中常用的扫描方案扫描有两种常用的方法:样品扫描和光束扫描。样品扫描提供了一个简单的设备,但通常较低的速度和较小的视野,而光束扫描更复杂的实现,对光学系统的性能要求更高,但提供了更大的视野和更高的成像速度。在样品扫描中,整个相干拉曼光学设置是固定的,样品相对于焦点平移。这意味着光学系统可以对准一个固定的激光束,这比在一系列可能的激光束位置上对准系统更容易。为了获得高的空间分辨率,需要一个平移阶段具有较高的精度和重复性要求。通常,采用压电驱动的弯曲级。这些阶段提供的步长和重复性远远超过光学显微镜(通常小于5 nm)和最大数百微米的平移所要求的。这种制度主要有两个缺点:一是图像的最大视场 ...
相干拉曼技术双束光同步的粗调与细调方法对于相干拉曼技术,两束激光必须在时间和空间上结合。常用的方法是使用二向色镜和几个转向镜进行精细调整,在空间上重叠光束相对简单。通常情况下,在组合光束路径中间隔约1米的两个光阑处的重叠可用于验证空间对准。可根据CARS或SRS信号强度进行微调。基于opo的系统中的时间重叠是通过基于反向反射器的被动延迟阶段来实现的,该延迟阶段允许在保持空间对齐的同时调整两个光束中的一个的路径长度(图1)。由于使用的激光系统的重复频率通常是80 MHz,两个脉冲之间的时间周期是p = 1/f = 12.5 ns。用这个周期乘以光速,得到距离约为3.75 m。因此,为了找到时间重 ...
搭建相干拉曼系统时如何验证信号的真伪与自发拉曼散射相比,CRS技术可以产生更强的振动敏感信号。CRS技术在光学显微镜中的普及与这些大大提高的信号水平密切相关,这使CRS显微镜的快速扫描能力成为可能。然而,除了更强的振动信号之外,相干拉曼相互作用还提供了丰富的探测机制,用于检查各种各样的分子特性。一般来说,CRS技术比自发拉曼技术对介质的拉曼响应提供了更详细的控制。所以在实际搭建相干拉曼系统时,会有诸多问题。当首次构建CARS或SRS显微镜时,很难确定PMT或锁相放大器探测器上观察到的信号的来源。然而,可以使用一个简短的检查表来验证信号的身份。通常情况下,应使用强谐振样品(例如,两个盖卡片之间的 ...
光源对相干拉曼显微镜系统性能的影响历史上,第一个相干拉曼显微镜使用了光谱可见区域的脉冲染料激光器。最近的系统已经使用了固体激光器系统,或基于电子同步钛蓝宝石激光器或同步泵浦光学参数振荡器(opo)的锁模激光器。新一代基于光纤的系统,无论是基于光子晶体光纤或有源光纤激光器中的非线性频率转换,都承诺提高易用性和更低的成本,但目前使用这些系统需要在性能上进行权衡。相干拉曼显微镜的激发需要(至少)两个激光波长,其中一个波长必须是可调的,以匹配分子振动频率的差频。此外已经证明,用几皮秒的激光脉冲宽度激发CARS和SRS可以理想地平衡高效生成非线性信号所需的高峰值功率与相对狭窄的光谱带宽(<1 nm ...
SRS是一种相干拉曼散射过程,可提供具有光谱和空间信息的化学成像。在典型的设置中,它使用两个同步脉冲激光器, 即泵浦和斯托克斯(图1), 以相干地激发分子的振动。为了从嘈杂的背景中捕捉到非常小的SRS信号, 高频调制和相敏检测方法是必要的。图1:检测到由于SRS导致的Stokes到泵浦光束的振幅调制转移。所展示的泵浦光束的重复率为80MHz,Stokes光束具有相同的80MHz重复率,但也在20MHz处调制。通过这个检测方案,Δpump被提取出来。为了进行实时双色SRS成像实验, 研究人员必须运用正交调制并检测同相和正交信号分量。“在大多数SRS光谱实验中, 由于激光器总带宽的限制, 光谱范围 ...
单频CARS与SRS显微系统单频CARS/SRS显微镜最具挑战性的部分是激发源,它必须产生两个同步的激光脉冲---泵浦和斯托克斯,需具有以下几点特征:1. 频率失谐在500和之间连续变化,以覆盖所有相关的振动跃迁。这意味着至少有一个泵浦/斯托克斯脉冲是广泛可调的。例如,假设一个固定的泵浦波长为800纳米,斯托克斯必须在835和1110 nm。2.脉冲持续时间为1 - 2 ps,对应于变换限制脉冲的带宽为以这种方式匹配压缩相中振动跃迁的典型线宽。这种选择优化了峰值功率和光谱分辨率之间的权衡。最佳脉冲持续时间也可以取决于实验条件,因为已经表明,在某些情况下,响应是一个与时间相关的函数,因此信号可以 ...
RS是另一种相干拉曼散射(CRS)过程,其激发条件与共振CARS相同。与自发拉曼散射不同,在自发拉曼散射中,样品被一个激发场照亮,SRS中两个激发场在泵浦频率ωp和斯托克斯频率ωs处重合在样品上。如果激发束的差频Δω = ωp−ωs与焦点内分子的振动频率Ω相匹配,即分子跃迁由于分子跃迁的刺激激发,速率提高。分子居群从基态通过虚态转移到分子的振动激发态(图1A)。这与自发拉曼散射相反,自发拉曼散射从虚态到振动激发态的转变是自发的,导致信号弱得多。图1.受激拉曼散射原理(A) SRS的能量图。泵浦和斯托克斯束的共同作用通过虚态有效地将样品中的分子从基态转移到第一振动激发态。被激发的振动状态可以通过 ...
时间。因此,相干拉曼散射方法,如刺激拉曼散射效应,现在被广泛用于拉曼成像。在这个应用说明中,我们将描述Moku:Lab的锁相放大器是如何在波士顿大学的先进的刺激拉曼成像装置中实现的。介绍拉曼光谱是一种非破坏性的分析化学技术。它直接探测样品的振动模式。与电子光谱法相比,拉曼光谱法提供了高化学特异性,而不需要荧光标签。样品可以以完全无接触和无标签的方式被询问,防止对系统的破话。红外(IR)光谱是另一种常用的获得振动光谱的方法。红外光谱和拉曼光谱的选择规则是不同的;红外光谱对偶极子的变化很敏感,而拉曼光谱对偏振性的变化很敏感。这使得红外和拉曼成为一组特定化学键的良好工具。对于成像和显微镜的应用,在选 ...
技术,是一种相干拉曼散射过程,允许使用光谱和空间信息进行化学成像[18],由于相干受激发射过程[1]能产生约103-105倍的增强拉曼信号,可以实现高达视频速率(约25帧/s)[2]的高速成像。SRS显微镜继承了自发拉曼光谱的优点, 是一种能够快速开发、label-free的成像技术,同时具有高灵敏度和化学特异性[3-6], 在许多生物医学研究的分支显示出应用潜力,包括细胞生物学、脂质代谢、微生物学、肿瘤检测、蛋白质错误折叠和制药[7-11]。特别的是,SRS在对新鲜手术组织和术中诊断的快速组织病理学方面表现出色,与传统的H&E染色几乎完全一致[12,13]。此外,SRS能够根据每个物 ...
行校正(因为相干拉曼成像使用两个光谱不一样的激光束)。文章创新点:基于此,GRINTECH GambH的Ekaterina Pshenay-Severin(第一作者)和莱布尼茨光子技术研究所的Juergen Popp(通讯作者)等人提出了一种结合紧凑型的四波混频光纤激光器的超紧凑光纤扫描内窥镜平台用于多模(CARS/SHG/TPEF)非线性内窥显微镜成像,并证明了在非线性成像应用(如图像引导手术和在体诊断)中的潜力。研发的核心部件有:(1) 便携式光纤激光;(2) 一种新型固体光纤,在两个分离的纤芯中引导激发激光,并在外部包层中收集信号;(3) 共振光纤扫描仪;(4) 实现激光复合(recom ...
存在的挑战。相干拉曼显微镜是一种非线性显微镜,可探测生物分子的振动光谱。它可以对化学键以极高的特异性进行无标记成像(特异性远高于使用荧光等可行的特异性手段)。这为研究广泛的生物活动(包括代谢活动、神经退行(nerve degeneration)、神经元膜电位和抗生素反应)提供了新的有力手段。当前不足:光损伤严重限制了相干拉曼显微镜的灵敏度和成像速度,为强大的前瞻性应用(如无标记光谱多路复用成像(label-free spectrally multiplexed imaging))带来了障碍。最先进的相干拉曼显微镜已经受到散粒噪声的限制。因此,无法通过改进仪器来克服这个障碍。文章创新点:基于此, ...
次谐波生成、相干拉曼反斯托克斯散射)可用作对比机制,以提供生物样品的补充信息。在相干非线性显微镜中,信号和散射方向由激发场分布和样品微观结构之间的相互作用产生,因此,定量图像解释需要建模描述。当前不足:现有的基于角谱表示(ASR)计算聚焦点附近的激发场分布,基于格林函数(Green)将非线性响应从聚焦区域传播到探测器平面的模拟策略及已建立的大多数数值模型忽略了焦点附近样品光学异质性引起的场的失真的影响。解决方案:巴黎理工学院的Josephine Morizet和Nicolas Olivier等人将有限差分时域(FDTD)方法(FDTD已被用于模拟宽场、共聚焦、相衬等多种显微镜,还用于计算光通过 ...
展构成了推进相干拉曼成像在便携性和医疗诊断或环境传感应用的灵敏度。实现了由掺镱(Yb 3+)光纤振荡器和FOPO组成的全光纤光源(图一),它提供了波长可调的同步皮秒脉冲,用于相干拉曼测量。它提供了三个而不是两个不同波长的脉冲,即斯托克斯脉冲以及波长交替泵浦脉冲,对于后来的 FM CARS 实验是必需的。产生的斯托克斯脉冲在振荡器内并用可饱和吸收镜 (SAM) 锁模,可在波长(WL 滤波器)在 1020 nm 和 1060 nm 之间,持续时间为 7 ps,并被放大(前置放大器和Amp) 分两级,在光隔离器 (Iso) 后面的输出处达到 400 mW。波长滤波器由一个基于光栅和紧凑型机电光束偏转 ...
时间。因此,相干拉曼方法,如受激拉曼散射如今被广泛的应用于显微镜研究。在这个应用指南中,我们将讲述如何使用Moku:Lab的锁相放大器进行受激拉曼散射的信号探测。背景介绍拉曼光谱是一种非破坏性的分析化学方法。它可以用来直接探测分子的振动模式。相比于基于电子能级的光谱光谱方法,拉曼光谱显著提高了测量的特异性,而且不需要在系统中引入荧光标记。被测样品能够以完全无接触,无标记的方法进行检测,防止了其他因素对系统的影响6,7。红外光谱是另一种常见的分子振动光谱方法。红外与拉曼光谱有着不同的选择定则。红外光谱对偶极子的变化敏感,而拉面光谱则对极化率敏感4。这使得红外与拉曼对特定的化学键振动有着更好的探测 ...
非线性光学的相干拉曼散射方法:受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)。相干拉曼效应最早是在1960年代发现的。在1990和2000年代末,由于超快锁模激光器的进步,谢尼(Sunney Xie)及其同事率先将CARS9和SRS10用于无标记化学显微镜。从那时起,这些技术已广泛用于化学,生物学和材料科学研究。 CARS和SRS有很多相似之处。这些非线性光学过程通常在相同条件下发生,并且仪器设置几乎相同。但是,有一些差异。就像自发的拉曼一样,CARS信号(图1中的ω为反斯托克斯)与入射光束(ωp,泵浦,ωs斯托克斯)的波长不同,使用短通滤波器很容易将信号从入射光中分离出来。到达检 ...
RAMOS CARS 3D成像系统多功能 - RAMOS CARS 结合: CARS扫描显微镜拉曼/荧光扫描共聚焦显微镜常规扫描共聚焦激光显微镜多通道 - 同时可高速测量的五个通道:前向探测 F-CARS后向探测 E-CARS和拉曼反射激光测量透射激光测量荧光测量特点高空间分辨:CARS XYZ < 0.7 μмRaman XY < 300 nm Z < 700 nm宽光谱范围:CARS 985 – 5000 cm-1Raman 75 – 6000 cm-1高光谱分辨:CARS 7 – 8 cm-1Raman 0.25 cm-13D CAR ...
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