在第 4 节中，我们重点讨论了如何在显微镜系统中产生和保持短的、高能量的激光脉冲。虽然这些是搭建 MPLSM 系统的基本方面，目前为止，我们还没有讨论通过使用激光的光栅扫描焦斑来构建图像的过程。在本节中，我们将简要描述图像构建过程（第 5.1 节）并概述激光扫描的基本原理（第 5.2 节）。然后简要讨论旁轴系统设计的局限性（第 5.3 节）。我们还将讨论使用计算机辅助光学设计来优化扫描时聚焦脉冲的空间特性（第5.4 和 5.5 节），以及如何改进FOV 和场曲（第 5.3a 和 5.5 节）。最后，我们将讨论扩展到涵盖提高数据采集率的多焦点方法（第 5.4 节）。
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多光子显微镜设计实用指南（11）
5. 中继系统TheImage relay system
在第 4 节中，我们重点讨论了如何在显微镜系统中产生和保持短的、高能量的激光脉冲。虽然这些是搭建 MPLSM 系统的基本方面，目前为止，我们还没有讨论通过使用激光的光栅扫描焦斑来构建图像的过程。在本节中，我们将简要描述图像构建过程（第 5.1 节）并概述激光扫描的基本原理（第 5.2 节）。然后简要讨论旁轴系统设计的局限性（第 5.3 节）。我们还将讨论使用计算机辅助光学设计来优化扫描时聚焦脉冲的空间特性（第5.4 和 5.5 节），以及如何改进FOV 和场曲（第 5.3a 和 5.5 节）。最后，我们将讨论扩展到涵盖提高数据采集率的多焦点方法（第 5.4 节）。
5.1 MPLSM系统的图像构建
如第 2 节所述，MPLSM 与其他成像方式相比的一个显着优势是它对混浊（例如生物）介质的散射相对不敏感。如第 2.3 节所述，非线性对比机制将激发限制在聚焦焦斑的体积内。这可以实现全场检测——消除共焦针孔——非线性信号由非成像探测器（例如光电倍增管）收集和量化。由于已知信号源自于焦点，因此所有收集的非线性光都可以归因于样本中的该点。
为了形成一幅图像，通过扫描聚焦于样本中的焦点来量化每个体素的非线性信号强度。一个简单并且直接的方法是，在激光焦点保持静止的情况下扫描样本来形成图像。但是样品保持静止，扫描激光的方法通常更受欢迎，尽管它更难以实施，但是这种方案具有卓越的图像采集速度和样品稳定性。激光扫描的方式要求在保持以物镜后背孔径为中心的情况下，光束的入射角发生变化；这样可以防止渐晕。因此，激光扫描过程不仅决定了FOV（field of view），而且对整个扫描区域的激发效率也有显着影响。
最简单的多光子显微镜版本是单焦点扫描感兴趣的区域的MPLSM系统。虽然已经报道了许多多焦点 MPLSM 系统，但我们首先以单焦点系统为例来说明光束传输到样品的问题。然后，我们将讨论范围扩大到包括多焦成像技术，并讨论由此类系统引入的一些独特问题。
5.2单焦点系统
在这里我们将重点介绍将轴向扫描与横向扫描解耦的系统。在该系统中，3维体积图像是通过横向平面的顺序扫描来收集的，横向平面垂直于光轴。因此，横向扫描是成像的关键。
为了使物平面上的焦点横向偏转，在物镜后背孔处对准直激发光束施加一个控制的入射角。如图17所示，在旁轴近似下，物体平面的偏转幅度（Δ）与物镜的焦距(f)和相对于光学后背孔径的光轴夹角的入射角（θ）成正比。激光扫描系统的关键在于设计一个系统，该系统可以在没有渐晕的情况下，改变物镜后背孔径的空间准直照明光束的入射角。
可以通过多种方式扫描激光光束的角度，包括声光偏转器 (AOD)、谐振和非谐振电流扫描镜、多边形扫描镜和微机电扫描镜 (MEMS) 。主要的方法是使用一对电流扫描镜，每个横向维度使用一个，在横向平面中偏转入射光束。图18所示为针对一个横向维度的示例，其中光轴用虚线表示。在物镜的后背孔径，我们要求光束准直入射，这样它就不会离开孔径（渐晕），角度随着扫描仪的旋转而变化。扫描光学系统的目的就是将扫描镜的光束偏转角映射到物镜的入射角。一个简单的解决方案是使用双远心系统将扫描镜图像中继到物镜的后背孔径。
像方远心是指光阑放置在光学器件之前， 这样不同视场角的主光线在焦平面上平行。与像方远心对应的是物方远心，两个系统的串联组合构成双远心。当扫描镜头被称为远心时，通常意味着镜头不仅满足 F-θ 条件，而且光阑被放置在扫描设备上，以确保远心性。
为了构建双远心中继系统，第一个中继透镜放置在扫描镜之后一个焦距处，第二个中继透镜放置在物镜后背孔径之前一个焦距处，中继透镜之间的距离为二者的焦距之和。请注意，远心区域位于镜头之间，而其他双远心系统则在中继系统的任一侧都是远心的。由于中继透镜的位置，这种配置被称为 4f 中继系统。 它们的焦距之间的任何差异都会导致一定的放大倍数。
DOI：https://doi.org/10.1364/AOP.7.000276
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