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Nature Photonics:多光子显微镜

发布时间:2022-03-24 11:43:13 浏览量:2499 作者:LY.Young 光学前沿

摘要

多光子显微镜(Multiphoton microscopy,MPM)被认为是活体、完整生物组织成像的手段之一,其成像尺度从分子级别到整个有机体。在2010年左右的时间段,被认为是侵入和光损伤最小的成像手段,因此适合长时间活体组织成像,时间尺度从微秒至数天或数周。可以观测到固有的详细动态生物过程。多光子显微镜相比其它类似光学成像技术,之所以有此优势,是因为它直接使用近红外飞秒激光生成可见光区域的可观测的非线性信号。近红外光相比可见光,具有更大的组织穿透深度(生物组织光散射的减少,正比于激发波长的四次方)。

正文


引言:

多光子显微镜(Multiphoton microscopy,MPM)被认为是活体、完整生物组织成像的手段之一,其成像尺度从分子级别到整个有机体。在2010年左右的时间段,被认为是侵入和光损伤最小的成像手段,因此适合长时间活体组织成像,时间尺度从微秒至数天或数周。可以观测到固有的详细动态生物过程。多光子显微镜相比其它类似光学成像技术,之所以有此优势,是因为它直接使用近红外飞秒激光生成可见光区域的可观测的非线性信号。近红外光相比可见光,具有更大的组织穿透深度(生物组织光散射的减少,正比于激发波长的四次方)。


原理简介:

(1)当同时到达样品上的两个或更多的光子的能量之和满足荧光基团从基态跃迁激发态的能量要求时,多光子激发发生。荧光信号可以是进入生物样品的外源探针(Hpechst,AlexaFluor488等),也可以是内源分子(NAD(P)H或逆转录荧光蛋白)。


(2)多光子成像二次谐波second harmonic generation, SHG)生成敏感,即两个光子瞬间将它们的能量转移到一个波长减半的光子上。二次谐波生成不需要荧光基团,但要求分子结构是高度有序和特别对称的。最常见的满足二次谐波生成的生物结构是胶原。




(3)多光子成像是一种非线性的过程,信号产生要求功率密度达到MW/cm2的量级。如此量级只有在显微物镜的焦平面才可以达到,因而将可以观测的信号限制在了焦平面。这带来的一个好处是,焦平面上下的光损伤会大大减小。飞秒激光有足够高的峰值功率,并维持一个低的平均功率水平,可以减小生物样品的光损伤。产生双光子激发荧光和二次谐波生成等非线性过程信号的强度正比于激光的强度




DOI:https://doi.org/10.1038/nphoton.an.2010.2


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