荧光成像已广泛应用于医疗实践，随着对光与生物组织相互作用认识的深入以及检测技术成本的下降，荧光成像波长整体上从可见光区域不断红移到近红外（NIR）区域。光在生物介质中传播时的能量损失可归咎于吸收衰减和散射干扰。吸收损耗决定了我们能否捕捉到信号，而散射信号总是降低图像的清晰度。此外，生物组织过度吸收光可能会导致组织损伤。一些生物分子的自发荧光总是与有用信号混合在一起，最终成为拍摄图像的背景。因此，光吸收和散射对荧光图像采集完全有害的根深蒂固的信念促使大多数研究人员追求具有最小光子吸收和散射的完美窗口用于生物成像。基于第二近红外窗口(NIR-II)的生物荧光成像被普遍公认为具有更小的光子散射，从而图像质量佳。特别是检测体内的深层信号时更倾向于这种窗口选择策略。
博览：2021 Light Sci Appl 近红外成像窗口的完善和延伸
技术背景：
荧光成像已广泛应用于医疗实践，随着对光与生物组织相互作用认识的深入以及检测技术成本的下降，荧光成像波长整体上从可见光区域不断红移到近红外（NIR）区域。光在生物介质中传播时的能量损失可归咎于吸收衰减和散射干扰。吸收损耗决定了我们能否捕捉到信号，而散射信号总是降低图像的清晰度。此外，生物组织过度吸收光可能会导致组织损伤。一些生物分子的自发荧光总是与有用信号混合在一起，最终成为拍摄图像的背景。因此，光吸收和散射对荧光图像采集完全有害的根深蒂固的信念促使大多数研究人员追求具有最小光子吸收和散射的完美窗口用于生物成像。基于第二近红外窗口(NIR-II)的生物荧光成像被普遍公认为具有更小的光子散射，从而图像质量佳。特别是检测体内的深层信号时更倾向于这种窗口选择策略。
NIR-II窗口的定义一直被限制在1000-1700nm，促使各种NIR发射器(emitters)的峰值发射波长超过1000 nm，甚至超过 1500 nm(NIR-IIb，1500-1700nm)。同时，一些现有和正在开发的荧光团的峰值发射低于1000/1500 nm，但明亮的发射尾(即发射曲线的拖尾，不是峰值部分)超过1000/1500 nm，因此也非常适合NIR-II/NIR-IIb荧光成像，这包括一些极好的聚集体探针(probes in aggregates)。目前来讲，明亮的长波长近红外发射器的设计和合成仍然充满挑战。此外，上述光吸收在 NIR-II 荧光成像中的积极作用可能会破坏超长发射器的特权，即，成像波长越长，成像性能不一定越好。此外，有机药剂(organic agents)一直被认为具有良好的生物相容性，但实际上很难让有机染料同时具备长波长和强发射。由于其发射拖尾通常占整体的一小部分，因此直接将药剂应用于某些给定的长通（LP）光谱区域中的检测并进行高对比度成像。但是，经验指导我们在确定成像窗口时要避开生物分子(如水)的光吸收峰。因此，考虑到吸收的积极影响，仍需要仔细验证用于成像的最佳 LP 波段。
微小生物结构的显微镜检查对于理解生物过程和诊断以及治疗某些疾病是必不可少的。NIR-II窗口的荧光宽场显微镜展示其在啮齿动物甚至非人类灵长类动物的生物组织中具有出色的深度成像能力。具有高时间分辨率的用户友好的成像模式可以帮助操作员实时监测血流等动态过程。然而，散焦信号和散射光往往与目标信息一起被收集，从而成为强背景，并降低图像对比度。因此一些先进的 NIR-II 显微成像技术，如共聚焦和光片显微镜等被提出来，旨在通过调整采集和激发模式来抵消图像背景。
当前不足：
如今，NIR-II荧光成像已经用于临床指导复杂的肝肿瘤手术。然而，光吸收的建设性作用在某种程度上似乎被忽视了。高质量图像的最终采集往往是通过使用更长的波长，夸大其对散射抑制的积极效果，并认为同时产生的吸收会衰减有用的信号。而事实上，一些工作已经揭示散射介质中吸收引起的分辨率增强，这是由于背景信号经历了更长的光程。然而，如何充分利用光吸收来选择合适的荧光成像窗口仍未明确。
共聚焦和光片显微镜等与宽场显微镜相比，引入针孔的扫描共聚焦显微镜不可避免地浪费了有用的信号并延长了成像持续时间。光片激发总是对样品的透明度提出很高的要求。因此，仍然迫切需要时空分辨率高、穿透力强、操作简便的显微镜。
文章创新点：
基于此，浙江大学的Zhe Feng(第一作者),Jun Qian(通讯作者)等人考虑生物组织内占很大比重的水的吸收作用，通过仿真和实验证明吸收对背景信号衰减的积极作用不应该被忽视，并根据水的吸收峰，重新完善并拓展了NIR窗口的划分。
(1) 用蒙特卡罗方法模拟生物组织中的NIR光子传播，并创新性地提出了1400-1500nm、1700-1880nm和2080-2340nm的良好成像性能，并定义为 NIR-IIx、近红外 IIc (NIR-IIc) 和第三个近红外 (NIR-III) 窗口。
(2) 借助硫化铅 (PbS) 量子点 (QD) 具有高荧光亮度和可调发射波长的优点。设计并合成了一系列PbS/CdS核壳量子点(CSQD)，然后用聚乙二醇 (polythylene glycol,PEG)将它们水合。借助峰值发射波长为~1100、~1300 和~1450nm的明亮QD，发现水吸收峰周围的检测区域始终提供极大的图像质量，因此NIR-II窗口的定义被进一步完善为900–1880nm。
(3) 定义为NIR-IIx区域的1400-1500 nm被证明提供比NIR-IIb区域更出色的荧光图像。体内NIR-IIx荧光显微脑血管成像展现出背景的强烈抑制，图像对比度极佳，成像深度达到~1.3 mm，代表了迄今为止小鼠大脑中最深的体内NIR-II荧光成像。
(4) 考虑到大量荧光团的发射峰值短于1400 nm，但保持明亮的发射拖尾，建议有效使用1400nm LP成像，其性能优于NIR-IIb区域。
原理解析：
(1) 由于散射光子比弹道光子在生物组织中的光程更长，光吸收优先消耗掉多次散射的光子。如图1所示，右图组织的光吸收要强于左图，产生了更强信号与背景比(SBR)的荧光图像。
使用Mente Carlo方法仿真光子在组织中的传播，目标物为一条线。当保持吸收系数不变，散射系数越小，全半高宽越小(见图2g)，信号与背景的比值(signal-to-background ratio,SBR)越大。图2a,b,c的散射系数分别为μs’ = 10 mm−1 ; μs’ = 3 mm−1 ; μs’ = 0.2 mm−1 ，吸收系数都为μa=0.3 mm−1。当散射系数保持不变，吸收系数越大，全半高宽越小(见图2g),SBR越大(见图2h)。图2d,e,f的μs’=1 mm−1,μa 分别为0.01, 0.1,和1 mm−1 。
(2) 根据水在700-5000nm范围内的光谱吸收分布，完善近红外区域的划分。由于1700-1880nm与1500-1700nm有相似的吸收和散射特性，以及980nm处有一个吸收峰，所以将NIR-II区完善为900-1880nm(一般为1000-1700nm，经典的InGaAs探测器将光学成像限制在1700nm以内),其中1700-1880nm为NIR-IIc，1400-1500n为NIR-IIx，1500-1700nm为NIR-IIb。由于2080nm和2340nm的吸收与1450nm处相似，将2080-2340nm划分为NIR-III。
水是生物体的主要组成部分，在~980nm,~1200nm,~1450nm,~1930nm有吸收峰(如图2i,j,k，j是k图实线框的局部放大，i是j实线框的局部放大)，1930nm的峰值时1450nm处的e100，因此不适合用于深层组织探测。在水的吸收峰处检测发射荧光能够极大的提高成像质量，但是由于光热损伤，具有强光吸收的窗口不适合做激发光。如图l-q，考虑水的吸收和皮肤的散射特性，对上述划分进行成像仿真，除了1880nm-2080nm由于极强吸收导致几乎观测不到任何东西外，光吸收的增加和光子散射的减少可以明显的提高成像质量。图2r为全半高宽，图2s为SBR分析。
实验证明：
(1) 900-1000nm应该包含在NIR-II窗口内。使用PEGylated 1100-Pbs/Cds QDs，其在水中的发射光谱见图3a，发射谱范围内的积分强度见图3b。虽然在生物组织内900-1000nm相比1000-1100nm散射效应更强，但是生物体内的水在900-1000nm范围内有更强的吸收(见图3c)。因此，可以从图3g,e,d,h可以看到，在散射与吸收的综合作用下，900-1000nm的成像效果不弱于1000-1100nm。更进一步分析，选取某一条局部的线来比较其SBR，可以知道900-1100nm甚至有略优的SBR，见图3f、i。
(2) 水对约1300 nm的不断增加的光吸收“开启”了 NIR-II 荧光成像的有前景的新阶段 。利用Pbs/CdS CSQDs，其在水中的发射光谱见图4a，发射谱范围内的积分强度见图4b。计算的1300-1500nm的荧光强度略低于1100-1300nm 的荧光强度，这可能归咎于水的吸收。从图 4c 中可以明显看出，从1100-1300nm到1300-1500nm的转变不仅减少了光子散射，而且显著提高了光吸收，这将使得背景抑制得到明显改善。见图4d,e,g,h,j,k，活体小鼠荧光成像时，1300-1500nm比1100-1300nm具有更清晰的图像效果，图4f,i,l量化的结果也表明其明显具有更佳的SBR。这证明了光吸收的显著增长而不是递减的光子散射决定了NIR-II荧光成像更有前景的阶段的开始。
(3) 最佳NIR-II成像窗口位于~1450nm处的强吸收峰附近 。利用PEGylated 1450-Pbs/CdS QDs,其在水和重水里的发射光谱见图5a,其在水中的发射荧光光谱积分强度见图5b。水在~1450nm附近有强吸收峰1400-1500nm的NIR-IIx窗口和1425-1475nm包含了最强吸收峰。再一次实验证明，强吸收能够产生更好的SBR，见图d-q。而~1450nm附近由于水的强吸收，以往一直是被认为不适合成像。在这里证明不仅适合成像，而且成像质量优于NIR-IIb的荧光成像。
深穿透荧光宫腔造影具有无创、空间分辨率高、无电离辐射等多种优势，为子宫异常和宫内病变提供了一种很有前景的诊断方法。此外，膀胱也是泌尿系统中的一个中空器官，负责储存和控制尿液。膀胱荧光成像有助于精确监测容量变化，这可能与包括贮积障碍在内的下尿路症状有关。图6显示了NIR-IIx荧光成像精确显现了体内的深层细节，具有推动临床医学成像的强大潜力。
(4) 通过 NIR-IIx 区域周围的荧光宽视野显微镜进行大深度断层扫描。用户友好的荧光宽视场显微镜作为一种经典技术，经常用于细胞或组织切片成像。近年来，宽视场显微镜的成像窗口已转移到NIR区域。如今，NIR-II荧光宽视场显微镜已成功穿透~800μm的大脑深度。然而，尽管成像深度很大，但焦平面诱导背景外的散射光子和信号光子将细节隐藏在“薄雾”之下。凭借上述水的峰值吸收波长附近的荧光成像出色的SBR和空间分辨率，NIR-IIx区域周围的宽视场显微镜被认为具有出色的性能，无需复杂的激发和采集模式。从图7a-p可知1425-1475nm的SBR是最高的，但是考虑到强烈的光吸收引起有用信号的损失，故将1400-1550nm确认为用于深层成像时的最佳波段。
使用1400-1550nm对小鼠大脑血管成像，在约~1.3 mm处，仍然存在可识别的血管，这是迄今为止小鼠大脑中体内NIR-II荧光显微镜最大的成像深度(超过 900 μm，潜在的白质可能成为进一步可视化的障碍，图像细节开始变得稀疏)。
(5) 离峰NIR-II 荧光成像(即使用发射尾端而不是峰值区域)最适合使用1400 nm长通 (NIR-IIx + NIR-IIb) 波段。利用IDSe-IC2F，其结构及合成示意见图8a,b。它的吸收谱见图8c，发射谱见图8d。在这里选用长波通荧光成像，IDSe-IC2F的长波通发射荧光光谱(900-1700nm,1000-1700nm,1100-1700nm,1200-1700nm,1300-1700nm,1400-1700nm,1500-1700nm)积分强度见图8e。静脉注射IDSe-IC2F NPs(1mg mL-1, 200 μL)后，在793 nm连续激光激发下对小鼠进行全身成像，相应图像在900/1000/1100/ 1200/1300/1400/1500-1700nm如图 8f-l 所示。经过计算（见图 8m），选定的三根血管在1400nm-LP图像中显示出最高的SBR。此外，进一步进行后肢成像，图8n-t中水吸收峰附近的背景抑制很明显。所选的两根血管的SBR 在1400-1700nm成像中达到最大值(图8u)。可以得出结论，NIR-IIx + NIR-IIb(1400-1700nm)成像的性能超过了NIR-IIb成像。此外，900-nm-LP 荧光成像的质量并不比1000nm-LP荧光成像的质量差，这再次表明 900-1000nm不应被排除在NIR-II区域之外。NIR-IIx + NIR-IIb荧光检测将为离峰荧光成像甚至临床成像引导手术带来新的思路。
参考文献：Feng, Z., Tang, T., Wu, T. et al. Perfecting and extending the near-infrared imaging window. Light Sci Appl 10, 197 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41377-021-00628-0
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