门控单光子雪崩二极管(SPAD)阵列在相量- flim的广域时间的上的应用，通过门长度、门数和信号强度可以提高测量寿命精度和准确度。该探测器的功能基本上是一个理想的镜头噪声限制传感器，并能够以视频速率进行FLIM测量。即使在门的数量很少和光子数量有限的情况下，在这项工作中使用的相量方法似乎非常适合处理由这种类型的非常大的传感器(512× 512像素)产生的大量数据。
在相量分析法中荧光寿命测量的应用
一．简介
在现有的许多光学成像模式中，荧光寿命显微成像技术（fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）由于其多功能性和特异性在生物科学和材料科学中特别受欢迎。荧光寿命显微成像主要针对的是分子级别的成像，可以做到排除干扰分子后，对感兴趣的分子进行针对性的成像，主要通过大量具有明显吸收和发射光谱的荧光团实现的。成为当前分子层面上荧光测试的首先，广泛应用在DNA测序、诊断、细胞成像、超分辨率显微镜，甚至是应用在疾病的纵向(前期)临床研究和治疗监测的体内成像。
相量分析法（phasor analysis，PA）可以通过时域和频域的转化直接进行荧光寿命的检测。与传统的分析方法（比如最小二乘法）相比，显得更加的简便快速，对光子数量少的情形下的测量尤为重要。数据信息的可视化和聚类分析的特点，相量分析法成为了科研工作者分析荧光寿命的首选。
门控单光子雪崩二极管(SPAD)阵列在相量- flim的广域时间的上的应用，通过门长度、门数和信号强度可以提高测量寿命精度和准确度。该探测器的功能基本上是一个理想的镜头噪声限制传感器，并能够以视频速率进行FLIM测量。即使在门的数量很少和光子数量有限的情况下，在这项工作中使用的相量方法似乎非常适合处理由这种类型的非常大的传感器(512× 512像素)产生的大量数据。
昊量光电推出了一款可以应用于相量分析荧光寿命的设备
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二．相量分析法（Phasor-FLIM）的原理介绍
频域法和时域法是相量分析法中核心，傅里叶变换技术可以让两者灵活转变，但它们获取荧光寿命信息的方式不同，得到的数据内容和形式不同，从而数据处理方法一般也不同。频域法一般使用正弦调制的连续光激发样品，测量得到的是具有相同频率的荧光信号，但由于荧光寿命的影响，荧光信号的振幅和相位相比激发光均发生了变化，因此通过计算荧光信号相对激发光的振幅调制度变化和相位延迟可计算得到荧光寿命。时域法则需要采用高重复频率的飞秒脉冲激光激发样品，利用前面提到的门控技术、扫描相机或 tcspc 技术等直接或间接记录脉冲过后的荧光衰减过程，得到的是荧光强度（或光子数）随时间的变化关系，因此一般可通过曲线拟合得到荧光寿命。
PA法最先被用于处理频域FLIM技术得到的荧光寿命数据，其相量由频域FLIM测量得到的解调系数和相位延迟来构建，是原始数据的直接表达。PA法同样适用于时域FLIM数据的分析，但需要先将时域的荧光衰减变换到频域。由 于时域FLIM中的TCSPC-FLIM目前应用最为广泛，因此 PA 法在该技术中的应 用也是报道得最多的。以下分别介绍这两类技术中PA法分析荧光寿命的基本原理，并结合荧光相量图的特点阐述其典型的应用思路。
通过求解系统信号相移和解调系数，然后会求解寿命, 即:
其中 fi 为第 i 个调制频率测得的光强占总光强的比例.
利用相量的概念对频域法 FLIM 得到的数据进行几何表示,他们利用单个像素点对应的解调系数M和相移f来构建一个相量,即以M作为该相量的模,以f作为该相量的辐角,则可以认为相量与像素点是一一对应的,相量图上一个相量的端点就代表了一个像素点的全部荧光寿命信息 (如图1(b) 所示).该相量在实轴和虚轴的分量可用 Weber 符号表示, 即:
对于单指数衰减情形, 可得到 cosf=M, 因此可以得到:
即以坐标(G, S)表示的相量端点被约束在原心位于(0.5, 0)处、半径为 0.5 的半圆上。半圆上的每个点表示不同的寿命，其寿命值从左到右递减，其中(1, 0)表示接近零的寿命，(0, 0)表示无限长的寿命，如图 1(b)所示。则根据衰减组分间的线性叠加性质，其在相量图上对应的相量端点应位于半圆以内，即多指数衰减过程对应的 G 和 S 应为：
几何意义上，多指数衰减过程对应的相量端点应位于其各个单指数衰减组分对应的寿命相量端点连接组成的集合内。如图 1(c)中，双指数衰减过程对应的寿命相量端点（蓝色）落在半圆以内，位于两个单指数衰减组分对应的寿命相量端点（绿色）的连线上，且与两端点的距离（p1、p2）由两个组分的占比（α1、α2）决定。
PA 法同样适用于时域法 FLIM 数据的分析。这里以目前应用最广泛的TCSPC-FLIM 技术为例。如图 1(d)所示，TCSPC 将每一次脉冲信号作为一个信号周期，每个周期内当探测到第一个荧光光子时就在其到达时间对应的时间通道中进行计数，经过多次累积即可建立一个反映荧光衰减过程的光子数-时间分布直方图，用于求解荧光寿命。
图1 荧光寿命的测量方法及相量分析 (PA) 法示意图 (a) 频域法测量原理示意图; (b) 单指数衰减的寿命相量示例图; (c) 双指数衰减的寿命相量示例图; (d) 时间相关单光子计数 (TCSPC) 测量原理示意图
三． 实验过程
3.1 SwissSPAD2技术概述
本文使用的探测器是SwissSPAD2 (SS2)，这是一种高速、大尺寸SPAD成像传感器，时间门集成在同一芯片上。该传感器芯片由512×512像素组成，在这里测试的相机模块中，只有472×256像素被启用。像素间距为16.38μm，相邻像素之间的串扰概率小于0.075%。由于每个像素的数字化特性(一个光子被检测，或没有)，相机捕获二进制图像，理想情况下是没有读出噪声的，使其适合单光子成像。每个像素有一个1位的存储电子器件，整个阵列以最高97.7kfps(每秒千帧)的速度被读取。每255个二进制帧序列在现场可编程门阵列(FPGA)上累积成8位门图像，通过USB3.0连接传输到PC机的数据采集存储器。更详细的SS2技术规格可以联系我们进一步沟通。
SS2使用其像素门电子技术进行时间分辨成像。使用FPGA上的混合模式时钟管理器(MMCM)模块，从激光控制器(或快速激光拾取PIN二极管)传输到相机的激光触发信号产生全局(阵列范围)门信号。简单地说，在每个1位的帧曝光期间(用户可选择最大400ns，最小50ns的倍数)，在每个激光脉冲之后，门被打开或关闭，任何检测到的光子都将像素存储设置为1。如果检测到多个光子，则忽略后续的光子。在设定曝光时间之后，读出1位帧，并重复该过程，直到获得用户定义的帧总数(8位门图像通常为255，或10位门图像为4×255)。然后将积累的门图像传输到PC，同时定义一个新的门位置，并重复这个过程以获得一个新的门图像，以此类推，直到获得所需数量的门图像。
SS2的栅极持续时间W比大多数常见的荧光团寿命要长得多(10 ns)，但相对于激光脉冲，可以非常精确地触发，步骤为17.9 ps。图2说明了典型栅极窗口的特征。通过记录探测器对20MHz脉冲激光的响应，在50ns激光周期内，利用阶跃17.9 ps的门图像，测量了该门曲线。图中显示了一个跨度为70纳秒的窗口，但栅极剖面的周期为50纳秒。
图2所示 FLIM实验中使用的栅极特性。在中心472×256数组中每隔4个像素的响应被绘制出来。最小可达到的栅长为10.8 ns
测试了七种栅极长度W在10.8 ns ~ 22.8 ns之间的栅极构型。门的长度和位置决定了SPAD在每次激光脉冲后的敏感时间窗。在固定的激光频率和强度下，较宽的光栅可以在给定的曝光时间内收集更多的光子，但代价是较低的光子到达时间分辨率。正如我们将看到的，这不是一个基本的极限。该软件允许选择门配置(长度)，每1位帧的激光脉冲数(曝光)，每个门图像的位深度(8或10位)(动态范围)，两个连续门位置之间的延迟(步长)，以及数据集中门图像的数量。
栅极特性影响时间分辨成像性能，影响荧光寿命测定的准确性和精密度。对于大视场系统，测量的空间均匀性是由栅边位置分布或倾斜决定的。在大尺寸传感器中，门信号的倾斜和高频信号切换期间可能的电压下降导致阵列的门边缘非均匀性。随着栅极长度的增加，上升边缘倾斜明显缩小(在表1的最后一行旁边)。这种效应可以归因于信号转换期间电源电压波动水平的差异。第一门信号跃迁(对应于大门的下降沿窗口自门推进对激光触发)导致门信号下降空间电源电压不平衡树,结果在第二斜门信号转变,在这种情况下,上升的边缘。随着栅极长度的增加，在较长的过渡延迟期间，电压降的较好的恢复降低了歪斜。由于栅门不均匀性的来源是确定的，它可以通过测量后的校准校正，如下一节所述。
闸门性能的另外两个关键参数是上升和下降时间。它们的主要影响因素是激光脉冲宽度、SPAD响应、门信号抖动以及门晶体管的开关速度。后者是由制造工艺约束决定的。由于电源电压摆幅随这些参数的变化，栅边的陡度也取决于读出速度和激光频率。因此，时间分辨率受到一系列随机效应的影响，其中一些我们无法控制，因此在这项工作中没有研究它们的影响。
SS2 10.5%的原生填充因子可以通过微透镜进行部分补偿。此次实验描述了，使用两个SS2相机(一个有微镜头，一个没有微镜头)，使用相同的相机曝光和照度设置，连续拍摄convallaria majalis样本图像。浓度因子(CF)定义为μm/μnm的比值，其中μm和μnm分别为有微透镜和无微透镜相机的平均光子数减去探测器暗计数后的CF=2.65，对应的有效填充因子为27.8%。
由于这一浓度因子低于理论计算值，我们在一个简单的光学装置上测试了这两个传感器，其中传感器和准直激光束(785nm, PiLas, a.l.s.，德国)之间的角度可以在两个维度上进行调整。对两种传感器进行了连续测试，测量出总光子数随入射角的变化。通过该方法计算得到，在3.5 V剩余偏置电压下，最佳角度下的最大浓度因子为4.46。这种与正常入射CF的差异可能是由于微透镜阵列相对于SPAD阵列的轻微错位或微透镜特性的局部变化造成的。
表1总结了SS2的性能，并将其与其他最先进的大画幅科学相机进行了比较。SPAD相机由于其数字特性，理想的读出噪声为零，因此它们可以用单光子灵敏度执行广域FLIM。与MCPs和基于光电阴极的探测器相比，他们的cmos技术是可扩展的，健壮的和经济的。在SPAD相机中，SS2采用了迄今为止最大的阵列尺寸，既能实现宽视场，又能实现高空间分辨率。
表1 参数列表
3.2 设备介绍
SPAD5122是一个512×512像素的单光子雪崩二极管图像传感器。它可以使光子计数达到每秒10万帧，读出噪声为零。 Global shut可以实现纳秒级曝光，曝光偏移为18 ps。该阵列优化为低噪声，典型的暗计数率小于25 cps。
表2 SPAD5122参数
图3 PDP 特性曲线
外观以及通讯接口：
3.3 影响数据的因素处理
获得的数据需要通过堆积校正，背景校正，降低噪声等手段获得理想的信息。由于摄像机存储方案，记录的信号不会与入射信号线性缩放。虽然这种校正方法有助于恢复入射衰减剖面，但堆积能显著降低信噪比(SNR)。在计算相量时，必须考虑由探测器噪声引起的不相关背景信号。背景不相关有多重效应。虽然这些方法不能减轻背景光子引起的色散的轻微增加，但它们改善了计算相量的位置和随后的分析。由于制造过程的不完善，阵列中有一小部分SPADs具有高暗计数率。所以可以设置一些感兴趣的关注点，对于感兴趣区域或ROI进行数据处理，而不是单个像素值进行分析，此时暗计数对计算出的ROI相量的影响减小，因此在大多数情况下可以忽略。
3.4 时间门控数据相量分析
3.4.1 相量校准
在实际应用中，实验门的形状和激光脉冲与触发信号之间的时间延迟(偏置)都会影响采集硬件记录的衰减的形状，衰减是采样信号与仪器响应函数(IRF)的卷积。使用已知寿命
的校准样本，可以很容易地校正IRF的效应。在相量表示中，IRF的存在只是对理论相量的模量进行缩放，并将其相量旋转一个固定的量(样本相量乘以IRF相量)。
利用定标样品的理论相量
可以测量定标样品的未校正相量
得到红外光谱相量。
图4 相量法的概念说明 (a)固定宽度W的栅极在50 ns荧光衰减周期内被扫描。每个栅极与一个纳米时间相关联，指定其相对于激光脉冲的开始时间。门图像中的每个像素包含在门口发现的光子数图像曝光时间。(b)的相量衰变(P)记录在给定像素的加权平均计算门图像强度乘以一个余弦或正弦项根据门时间)
事实上，相同的校准方法通常可以很好地纠正由门控过程带来的衰减修正，这相当于一个积分，而不是卷积：
其中
是一个校准因子，结合了IRF和Gate对记录的衰减的影响。式(8)在本工作中所研究的所有情况下都能令人满意地工作，只要门数G不太小（实际G>10）。
校准因子
可以为每个像素(使用相量校准图像)，或为每个ROI(使用相量校准地图)，或为整个帧全局(单相量校准)计算。在本研究中，由于栅极特性，我们计算了覆盖整个视场的连续4×4像素ROIs的校准因子。
四． 结果：
4.1 SS2时间门控数据记录
图5 (a)ATTO 550，(b)Cy3B， (c)罗丹明6G(R6G)，和(d)量子点(QD585)溶液的门强度曲线(坐标(193,190))。参数:激光频率:20 MHz，门宽W = 13.1 ns，位深:10，背景校正:off。蓝色:无堆积修正，红色:堆积修正。
图5显示了本文各种实验中使用的四种市售荧光样品的荧光衰减谱，由SS2用W = 13.1 ns栅极宽度和17.86 ps栅极步长(总共2800个栅极)记录。ATTO 550, Cy3B和罗达明6G (R6G)样品(图5(a) (c))是水溶液夹在由1mm厚橡胶垫圈隔开的两个玻璃覆盖物之间，允许测试探测器的宽场响应均匀性。这些样本还被用于研究相量分析性能对各种采集参数的依赖性，如后面一节所述。图5(d)显示了水量子点(QD)样品(Qdot585 Streptavidin, ThermoFisher Scientific, 1 μM)在玻璃覆盖层上晾干后的衰减剖面，导致了随机的不均匀密度模式，其特征是视场的平均相寿命不同，稍后将讨论。三种染料溶液的浓度不同(水缓冲液的浓度为10nM-1μM)， ATTO 550的浓度最低，导致明显的颗粒噪声，而较亮的样品R6G的影响最小。这一变化为研究光子计数对寿命测定性能的影响提供了机会。
4.2 SS2数据相量分析
SS2的相量分析的结果与测量数据如图6所示的三个荧光染料与类似的激发和发射光谱(吸收峰约550nm,发射峰周围570nm),但不同的一生:Cy3B R6G和阿550(文献值:τ= 2.8 ns,分别4.08 ns和3.6 ns)。在实验中，用脉冲宽度为100 ps的532 nm 20 MHz脉冲激光器(LDH-P-FA-530XL, PicoQuant，德国)激发所有染料溶液。选择ATTO 550作为中间寿命物种，计算一个分置(4 4)校准图，用于校准其他两种染料样品(Cy3B &R6G)，在方法中解释。ATTO 550、Cy3B和R6G具有相似的光物理性质，但在532 nm激发时，R6G比其他两种光略亮(比Cy3B亮两倍，比ATTO 550亮三倍)。此外，由于ATTO 550样品的浓度低于另外两个样品，我们用较大的积分时间对其较低的信号进行补偿(另外两个样品用10位数据代替8位数据)。计算的相位散点图。
图6(a)-(c)分别表示2800、140和16个栅极位置计算的相量散点图。由于总信号的减少，相量色散明显地随着门数的减少而增加。然而，这两个物种仍然可以通过16门来分辨，有效帧率为12.1 fps，这表明对于这些寿命差异为1.4 ns的特定样本，在实时采集速度下可以对相量图上的染料进行识别。
相量值可以转换为相位寿命值(使用公式(5))，从而得到具有平均值和标准差的正态分布，如表2所示。与文献值相比，测量的寿命显示了轻微的负偏置(Cy3B为300 ps或10%，R6G为200 ps或5%)，但与使用配备不同脉冲激光源的共聚焦TCSPC装置测量的结果相匹配(数据未显示)。它们的标准偏差尺度为g-1 /2，其中G是用于计算的门的数量，就像预期的射击噪声限制信号(公式(12))，因为计数的数量与用于分析的门的数量成比例。
图6 R6G(τ = 4.08 ns)和Cy3B (τ=2.8ns)在2,800 (a)、140 (b)和16 (c)门位置得到的解的相量散点图，并使用对应的ATTO 550数据集(τ= 3.6 ns)校准。当使用更少的门(因此也就更少的光子)时，两个样品相量的视觉分离变得更具挑战性。即使只有16个栅极，这两个样本也能明显区分开来。实验参数:激光和相量频率:20 MHz，门宽:13.1 ns，阵列尺寸:472 256，箱数:4 4，位深:8 (R6G &Cy3B)，16 (ATTO 550)，堆积校正:开启，背景校正:开启，移除像素百分比:0% (R6G &Cy3B)，0.5% (atto550)
表3。从图6中得到的相位寿命和标准偏差(以ns为单位)。测得的相寿命略短于文献值(Cy3B: 2.8 ns, R6G: 4.08 ns)，公式(12)的标准差为g-1 /2。
4.3复杂样本的阶段生命周期图
相量法的一个强大的方面是它在相量图中对样本寿命的二维表示。物种的特征是一个指数衰减与τ一生都位于一个定义良好的地区接近通用圆(加州大学),很容易区分与不同时间的样品(见例如图6)。一个示例包括两个荧光物种不同寿命局部独立的地区在图像中，相量图将在相量图中显示两个单独的相量簇。然后简单关联的位置相量的相量图和相应的位置在图像来源,例如红色和绿色都表示测量出了不同寿命值。在任何其他情况下(例如，当不同的物种具有不同的生存期，但在图像中集中)，相量将是中间的，并且就生存期而言的解释更加微妙，但仍然可以使用类似的和有用的颜色映射，如下所示。
说明这个实用方面的相量图SS2特定情况下的传感器,我们研究的样本一样商业量子点发射光谱范围前面所讨论的有机染料样品(Qdot 585链霉亲和素,峰值发射波长:585nm),但是更长的寿命(参见图5 (d))。量子点(QDs)除了具有较长的寿命外，通常还表现出尺寸上的多分散性，这导致其光物理性质(如发射光谱峰值、寿命等)的异质性，这也取决于其所处的环境。
将该QD样品的10μl原液(浓度为1μM)放在盖玻片上晾干，并使用与之前测量相同的设置在环境条件下成像。对应的强度图像如图7(a)所示，其特征是高QD浓度的明亮随机条纹，点缀着低浓度的区域(条纹和干燥的微滴区域)。该图像中每个像素的相量(使用前一节描述的Cy3B样本校准)表示为图7(d)所示的二维直方图。相位寿命τR = 13.9 ns和τG = 16.7 ns均较接近UC，并沿红点和绿点排列。使用每个相量与这两个参考点的相对距离(或相量比rG，公式(16))对源图像中的原始像素进行颜色编码(rG = 0:红色，rG = 1:图7(b))所示的蓝色，中间光谱颜色比例图，产生图7(b)所示的相量图，其中每个像素的颜色对应于其相量比。
将该QD样品的10μl原液(浓度为1μM)放在盖玻片上晾干，并使用与之前测量相同的设置在环境条件下成像。对应的强度图像如图7(a)所示，其特征是高QD浓度的明亮随机条纹，点缀着低浓度的区域(条纹和干燥的微滴区域)。该图像中每个像素的相量(使用前一节描述的Cy3B样本校准)表示为图7(d)所示的二维直方图。相位寿命τR = 13.9 ns和τG = 16.7 ns均较接近UC，并沿红点和绿点排列。使用每个相量与这两个参考点的相对距离(或相量比rG，公式(16))对源图像中的原始像素进行颜色编码(rG = 0:红色，rG = 1:图7(b))所示的蓝色，中间光谱颜色比例图，产生图7(b)所示的相量图，其中每个像素的颜色对应于其相量比。
图7 QD阶段生命周期图。(a):干燥QD样品的强度图像。对比度已经调整，可以看到大部分的视野。比例尺为25 μm。(b)，(c):用颜色编码的阶段寿命图。两个引用(绿点:16.7 ns和红点:13.9 ns)定义的相量图(d)所示。像素颜色根据他们的相量比这两个引用和使用b。像素的光谱颜色规模表示相量接近第一个参考(绿点:较长的生命周期)被标记为蓝色，而相量接近第二个参考点的像素(红点:较短的生命周期)被标记为红色。像素与相量之间的颜色与一个中间颜色。线段外的点根据线段上最近的点着色。细长的六边形代表相量图区域的边界，适用于这种颜色编码方案。在b中，对所有像素保持相同的亮度，不管它们的实际强度，允许显示低强度像素(和它们的相位寿命)。寿命与强度之间没有明显的相关性，而浓度与寿命之间似乎存在相关性。(d):底部:a所示数据的相量图。顶部:底部相量图所选方形区域的细节。两个参考点(绿点和红点)在相量云的两端都可见。
五． 讨论
在这项工作中，我们研究了一种新的宽视场时间门控SPAD阵列的FLIM使用相量方法的性能。在该传感器中，我们实现了相对较长的时间门。这种设计选择与大多数时间门控检测器不同，它需要降低每个像素的间距并将阵列放大到较大的格式，而时间门控检测器则力求实现尽可能短的门控持续时间，以模拟TCSPC技术的性能。此外，每个像素的数据内容为1位，对应于每个读出周期的光子计数为1或0。传感器的这种特性导致需要在像素级进行堆积校正。
大视场时分辨成像系统的整体性能可以用两种不同的方式来定义。第一种方法是找到所需的时间，以给定的精度确定一个固定像素区域的生命周期，对照明级别没有限制。该参数由减少的光子经济(由测量寿命或f值上的归一化相对误差表示，公式(9))和最大本地光子计数率决定。然而，在某些情况下，可接受的照明水平是有限制的。在发射强度在探测器动态范围内的情况下，系统的性能由像素的灵敏度和光子效率决定。要定义SS2的当前和潜在功能，必须很好地理解每个参数的限制。
根据定义，最大局部计数率是两个可探测光子之间的最小延迟的倒数。在SS2的全局快门模式下，由于像素内存储器只能存储一个光子，所以这个延迟等于曝光和读出时间的总和。如果SPAD在一帧中检测到一个以上的光子，那么除了第一个光子外，所有的光子都会被错过。这种现象被称为堆积，会导致荧光衰减形状的扭曲。这里使用的堆积校正(式(1))部分恢复了光子分布;然而，它不能改善由于光子丢失而引起的信噪比下降。为了减少堆积，所有门的每帧平均光子数必须保持在1以下。为了计算最大局部计数率，可接受堆积的最大允许光子计数必须乘以门响应的平均强度和峰值强度的比值，该比值受样品寿命门长度和激光脉冲宽度的影响。增加像素内存储器的位深度或读取速度是增加最大计数率的两种可能方法，代价是增加后脉冲(这将显示为FLIM pur姿态的背景噪声)。这两种解决方案都需要额外的芯片面积，因此它们会带来填充因子的损失或像素大小的增加。
该成像仪的灵敏度由SPAD的光子探测效率和像素死区时间决定。PDE是SPAD检测到的入射光子的百分比，等于PDP和填充因子的乘积。为了改善偏微分方程，在成像仪上沉积了微透镜。SS2上微透镜的浓度因子在2.6 (Vex = 6.5 V)到4.5 (Vex = 3.5 V)之间，有效填充因子在28%到47%之间。死时间是传感器操作期间对光子不敏感的时间。SS2在低堆积状态下工作时，死区时间包括全局快门模式下的读出时间和栅门关闭时激光周期的持续时间。第一个问题可以通过切换到卷帘模式来解决，在这种模式下曝光和读数同时发生。对于目前的芯片版本，此操作需要对配电网进行改进。第二个问题可以通过向像素添加第二个门来解决。这种双栅结构使像素在整个激光周期内都是敏感的，同时通过将光子分配到两个门中的一个来记录时间信息。有了这两个附加条件，死时间就可以几乎消除了。
六． 总结
在接近视频速率(12.4 fps，图7(b))的情况下，实现良好的寿命精度和高精度(140 ps)的能力是实时FLIM的一个令人鼓舞的里程碑。为了充分实现这一目标，下一步将涉及到FPGA上实现相量计算，实现高吞吐量的数据处理。复杂混合物中物种组分的提取也是flam - fret测量的重要一步。提高灵敏度，实时时间门控成像和多物种量化的结合将扩展该传感器的能力，以满足高速和高精度的应用，如小动物成像。
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