超越衍射极限分辨率的光学成像技术推动了细胞内研究和单分子水平化学反应研究的发展。超分辨率受激发射损耗显微镜可以实现具有超高时空精度的三维成像。对于单分子检测和定位技术，如随机光学重建显微镜或光激活(photo-actived)定位显微镜,可光开关探针(photo-switchable probes)的位置定义为衍射极限点的中心位置。多次重复成像过程，每一次对不同的随机激活荧光团成像，可以实现纳米级的重建分辨率。然而，对样品透明性的要求，使得这些超分辨显微镜技术不可能用于被强散射介质(如生物组织、磨砂玻璃、粗糙墙角等)掩埋的物体。这些介质对光的吸收不强烈，但是扰乱了光路，产生像噪声一样的散斑图样，甚至使得样品低分辨率的可视化都很难实现。
博览：2021Nat Commun穿透动态散射介质的非侵入性超分辨率成像
技术背景：
超越衍射极限分辨率的光学成像技术推动了细胞内研究和单分子水平化学反应研究的发展。超分辨率受激发射损耗显微镜可以实现具有超高时空精度的三维成像。对于单分子检测和定位技术，如随机光学重建显微镜或光激活(photo-actived)定位显微镜,可光开关探针(photo-switchable probes)的位置定义为衍射极限点的中心位置。多次重复成像过程，每一次对不同的随机激活荧光团成像，可以实现纳米级的重建分辨率。然而，对样品透明性的要求，使得这些超分辨显微镜技术不可能用于被强散射介质(如生物组织、磨砂玻璃、粗糙墙角等)掩埋的物体。这些介质对光的吸收不强烈，但是扰乱了光路，产生像噪声一样的散斑图样，甚至使得样品低分辨率的可视化都很难实现。
许多方法已被证明可以克服散射效应并通过散射介质实现成像或聚焦。最直接的策略是利用弹道光子。然而，强散射介质会减少弹道光子的数量并极大地降低信号强度。某些技术需要导星(guide star)或进入散射介质的另一侧，以在成像之前表征或反转其散射效应，例如波前整形技术或传输矩阵测量。另一种方法依赖于光通过散射介质的记忆效应，这意味着有平移不变点扩散函数 (PSF)。具有已知PSF的散射介质（通常被侵入性测量）可以被视为散射透镜，用于通过反卷积进行成像。与任何传统透镜类似，散射透镜只能分辨由其数值孔径(NA)定义的衍射极限的物体。解卷积成像目前以最少的介质特征（单次 PSF 测量）从散斑图样获得最佳分辨率图像。但是，每个测量的 PSF 仅对测量时的散射特性有效；因此，解卷积方法对于静态散射介质很有效，但它不能实际用于动态散射介质。实际应用需要通过散射介质进行非侵入性成像，其在没有任何散射介质测量的情况下恢复图像。扩散光学层析成像(diffuse optical tomography)和飞行时间成像是可能的解决方案，然而，其分辨率比光学衍射极限低几个数量级。由于薄散射介质的平移不变散斑型PSF，可以通过相位复原算法从散斑图样中非侵入性地重建样品的二维图像甚至三维图像。
当前不足：
算法和相机的有限性能，以及噪声和样本的复杂性等因素，对于经过散射介质成像，通常使图像复原过程失败或收敛到有伪影的、与衍射极限以及解卷积图像相比分辨率较低的情形。
文章创新点：
基于此，新加坡南洋理工大学的Dong Wang(第一作者)和Cuong Dang(通讯作者)等人提出了一种随机光学散射定位成像 (stochastic optical scattering localization imaging,SOSLI) 技术，实现经过散射介质的非侵入式超分辨成像。该技术只需要一个图像传感器采集闪烁点源经散射介质形成的散斑图样，点源在每一个随机相机帧中的位置通过计算的方式以非常高的精度确定，从而可以实现超分辨图像重建。最终证明实现的分辨率超过了衍射极限，散射介质后100nm的特征可以被清晰分辨。SOSLI的分辨率极限受信噪比(SNR)约束，这一点与其它用于透明样品成像的计算超分辨率显微镜技术类似。作者开发了自适应SOSLI以通过动态散射介质(例如新鲜鸡蛋壳膜，其相关性低至0.2)进行超分辨成像。所提SOSLI技术可以穿透类似于生物组织或磨砂玻璃这样的半透明介质，成像分辨率达到亚波长级。
原理解析(数学原理和实验装置见附录)：
(1) 采集散斑图像。物体O由随机闪烁的点源组成:O=ΣOi,Oi是第i个闪烁图样(i=1,2,…N,N是闪烁图样的总数)，即O的子集。当光经过散射介质后，每一个Oi在相机上产生一个散斑图样Ii。见图1a。
(2) 从散斑图像的自相关通过相位复原方法重建出相应的点源图像。如果物体的尺寸满足散射介质的记忆效应(即此尺寸范围内，任意两点发出的光经过散射介质后的散斑相关，相关指的是散斑图样发生平移，但是散斑图样分布几乎一致)，那么散射介质的PSF是平移不变的。因此，可以通过计算物体Oi的散斑图样Ii的自相关来得到对应物体的自相关。由自相关定理可知，一个函数的自相关的傅里叶变换等于其傅里叶变换振幅的平方，因此，缺少物的傅里叶变换的相位信息，Oi需要通过相位复原算法从它的自相关重建而来。见图1d。
(3) 应用定位算法获得超分辨率的点源图像。但是，受限于相机的位深、光子预算(photon budget)、在存在图像采集噪声情况下的相位复原算法的性能下降等因素，这种非侵入式的图像恢复方法的分辨率会有所下降。然而，一个标准的定位算法(随机光学重建显微术里的定位算法)可以以非常高的分辨率找到点源的位置，并且移除算法带来的伪影。与其它定位显微镜技术类似，样品的点源越稀疏，重建精度越高，这种稀疏指的是在衍射极限区域内，一次只激活一个点源。锐利和清晰的图像Oi’表示了闪烁图样Oi的点源的精确相对位置，但是丢失它的真实绝对位置信息。这是因为Oi’仅仅通过求解Ii的自相关获得Oi的自相关而求得。见图1e。
(4) 估计出PSF。因此，散射介质PSF的估计值可以通过解卷积的方法获得：PSF’= Deconvol(Ii,Oi’)，这个PSF也是相对真实PSF发生了平移的，因为Oi’相对Oi发生了平移。除了丢失精确位置外，相位复原算法无法通过中心反演(central inversion)区分真实解及其翻转。因此，通过推导Oi的不同反转版本对应的不同的PSF’，然后在与另一个散斑图像Ii的解卷积中验证它们以确定正确解。值得注意的是，相位复原算法对稀疏样本的性能更好。这种相位复原解决方案会影响子序列的定位和PSF的估计，因此，应该选择对比度最高的散斑图像进行相位复原和PSF估计。见图1f。对于动态的散射介质，需要采取自适应的方式更新PSF，而不是采取静态PSF。
(5) 由散斑图样和估计的PSF求解卷积求出物。对采集到的Ii与PSF’求解卷积并使用定位算法，重建出一系列清晰的由点源组成的超分辨Oi‘图像。完整样品的超分辨图像由Oi’叠加完成：O’=ΣOi’,i=1,2,…N。这种方法有效的前提是，在Ii序列中，PSF不变。见图1g、h。
视频：通过动态散射介质的非侵入性超分辨率成像
附录：
（1）散斑自相关成像数学原理
散斑强度分布I(x’,y’)可以表示为物函数O(x,y)和系统平移不变点扩散函数PSF的卷积
(x,y)表示物空间坐标,(x’,y’)表示像空间坐标。
散斑强度分布已知后，通过计算散斑的自相关，可得
即相机记录的散斑强度图的自相关等于物函数的自相关和系统PSF自相关的卷积。假设系统PSF的自相关为尖锐的峰值函数，则（2）可以简化为如下
其中B为背景噪声。由（3）可知，在去除背景噪声的情况下，通过计算散斑强度分布的自相关可以得到隐藏物体的自相关。（通常可以认为散斑强度图的自相关等于物体的自相关加上一个常数背景项）
为了恢复隐藏的目标物体，对（3）两边同时做傅里叶变换
（4）表明，散斑强度分布自相关的傅里叶变换等于物体傅里叶振幅的平方，等式两边求均方根可得物体的傅里叶振幅分布
散斑强度分布的自相关可以通过二维傅里叶变换与逆变换来计算
由于有效的目标信息只集中在散斑场图像自相关的中间部分，为了实现高效的图像重建，在计算的散斑自相关分布中增加窗口函数之后再进行傅里叶变换来求解傅里叶空间的振幅信息
其中W(x,y)表示窗口函数，窗口的大小可以根据被测目标的尺寸进行选择。
因此，通过计算散斑强度分布的自相关，可以获得物体傅里叶空间的振幅信息，由于物体傅里叶相位信息的缺失，不能通过直接逆傅里叶变换的方式求得物体分布，但是可以通过Fienup提出的相位复原算法求得。算法流程见下图。
由于物体被隐藏在散射介质之后，无法获得任何物体的初始信息，因此，假设一个初始随机振幅分布作为初始目标物
在第m次迭代后，可得到恢复的物体为gm(x,y)。再进行二维傅里叶变换，可得
在迭代过程中，保持相位不变，通过(7)测量的傅里叶平面的振幅分布代替计算得到的振幅分布，获得新的光场
通过逆傅里叶变换求得物体的复振幅分布
第m次迭代求得的复振幅，在输入下一次迭代之前，需要对原有函数增加约束条件，即：恢复的目标为非负实数。当第m次迭代求得的复振幅中的元素满足这个条件时，就保留这些值不变，当不满足时，通过两种算法进行约束，分别为误差下降法(Error Reduction,ER)和混合输入输出算法(Hybrid Input-Output,HIO)。
ER的约束条件为
Ω表示函数gm(x,y)中满足是空间约束的元集合。ER算法在迭代之初收敛速度很快，但在后续的迭代中收敛速度变得极为缓慢。
HIO的约束条件为
β为引入的控制算法收敛的反馈参数。HIO算法的一个重要特征是在没有噪声存在的情况下，该算法可以避开局部极小而完满地收敛到全局极小。但是当实验数据存在噪声时，该算法通常会不收敛。
在实际应用中，通过将ER算法和HIO算法结合使用，其效果由于任意一种算法的单独使用。
（2）实验装置
参考文献：Wang, D., Sahoo, S.K., Zhu, X. et al. Non-invasive super-resolution imaging through dynamic scattering media. Nat Commun 12, 3150 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-23421-4
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