液态变焦透镜在显微镜领域的应用

正文

液态变焦透镜在显微镜领域的应用

（本文部分译自Focus-Tunable Lenses Enable 3-D Microscopy（DAVID LEUENBERGER, OPTOTUNE AG, AND FABIAN F. VOIGT, UNIVERSITY OF ZURICH））

 

1.介绍

显微镜初学者可能会感到困惑，当他们注意到样本中只有轻微失焦的部分在图像中看起来却模糊得多。人眼看到的景深似乎比相机看到的景深要大得多。这种令人困惑的效果之所以发生，是因为眼睛能够调节焦距：在使用显微镜观察时，用户会不断地——通常是无意识地——通过调整眼球晶状体的焦距来改变聚焦平面，而不需要触摸调焦旋钮。因此，自显微镜发明以来，可调焦距的镜头能够帮助研究人员对微观物体的三维形状和纹理有了更直观的感知。

 

在现代显微镜中实现类似装置，用于电子图像采集是非常理想的。如今，科学家们越来越需要在越来越短的时间尺度上，以高空间分辨率成像活体生物的结构和功能。现代生物显微镜也在逐渐从成像夹在载玻片和盖玻片之间的小样本，转向3D细胞培养、整个胚胎，甚至在动物体内成像，以便在更自然的环境下研究发育和生理学。

 

传统获取三维成像数据需要通过使用载物台或压电驱动的物镜Z轴扫描器来机械地移动物镜或样本。由于这些设备中移动部件的机械惯性，实现数百um Z范围内的体积扫描速率超过10至20 Hz是非常具有挑战性的。

 

一种称为“远程聚焦”的替代解决方案涉及改变光线进入或离开显微镜物镜时的会聚度，以分别诱导激发或发射焦点的轴向移动。各种可调光学元件可以用于此目的：例如，空间光调制器、可变形镜和变焦透镜。由于其低成本、简单的构造和控制以及广泛的调焦范围，可调焦距透镜特别适合于要求快速体积采样且分辨率适中的显微镜应用。

 

在这篇应用文章中，我们专门讨论了沿光轴聚焦的液态变焦透镜的使用。根据液态变焦透镜的实现方式和光学性能要求，可以实现 30-700 um的轴向聚焦范围。关于在显微镜中使用液态变焦透镜的大多数讨论的技术细节，也适用于其他应用。液态变焦透镜具有大光圈、快速响应和驱动时间以及良好的光学质量，为显微镜下的多种应用提供了广阔的前景。在本应用文章中，我们讨论了在三种不同的显微镜方法中实现快速轴向聚焦的液态变焦透镜的应用：(1) 传统的宽场荧光显微镜，(2) 荧光共聚焦显微镜，以及 (3) 双光子显微镜。

 

 

2.液态变焦透镜技术

Optotune的液态变焦透镜基于弹性聚合物材料。透镜的核心部分由一个薄膜组成，它在充满液体的腔室和空气之间形成一个界面（图1）。为了调节焦距，一个音圈执行器对围绕透镜清晰孔径的液体储层施加压力。液体因此被压入透镜中心，改变薄膜的曲率。控制液态变焦透镜非常简单，只需要一个现成的电流控制器或透镜驱动器，为透镜提供0到290 mA的电流即可。

图1  (a, b)：Optotune液态变焦透镜的工作原理。电流控制的电磁或机械执行器向下推动充满液体的镜头容器，迫使镜头液体进入镜头中心并改变其形状 (c) 对于ETL，Optotune提供了一个软件控制的镜头驱动器（d）它提供电流 (e) Optotune的ETL的典型响应时间约为5 ms量级。实际的稳定时间会随着镜头孔径的变化而变化。感谢Optotune提供的信息。

有一系列液态变焦透镜可供选择，其孔径范围从6 mm到16 mm不等。具有高色散和低色散镜头液体的版本，其典型的焦距范围分别为52到120 mm，或80到200 mm。在操作过程中，控制电流可能会加热镜头，导致温度依赖的焦点漂移。由于液体镜头的热焦距膨胀大约是玻璃镜头的100倍，因此镜头需要集成温度传感器。结合靠近液体的温度传感器以及镜头上存储的校准曲线，USB驱动固件可以计算出正确的电流值，以设定并保持镜头在给定的焦距功率。

 

液态变焦透镜的一个巨大优势是其响应时间非常短，只需几ms。图1e显示了作为时间函数的归一化折射功率对矩形阶跃脉冲的典型响应示例。液态变焦透镜在240至2500 nm范围内提供大的透射率，并具有高损伤阈值（在1064 nm连续波操作下为10 KW/cm2），并且它们保持光的偏振态。

 

3. 在显微镜中集成液态变焦透镜

液态变焦透镜可用于显微镜的不同应用。这些包括专门的可调照明系统以及电控变焦光学系统等。

在标准显微镜中，轴向聚焦通常是通过移动样品在 z 轴上或显微镜物镜上移动样品来实现的。精确聚焦的常见替代解决方案是使用压电驱动的物镜支架。然而，这些聚焦技术是基于相对于样品的机械轴向移动。如果使用光学聚焦方案，可以实现无移动甚至更快的聚焦。实现光学聚焦的一个便捷方案是在显微镜的光路中加入液态变焦透镜。

现代显微镜使用无限远校正物镜，这意味着从样本发出的光线以平行光束的形式从物镜中射出。为了创建图像，需要一个额外的管镜头（图2）。相反，通过将准直激光束送入物镜，激光被聚焦到样本内部的焦点。通过可调焦镜头改变光束的准直状态可以移动焦平面。例如，当将发散光束送入物镜时，焦点会从其前透镜移开。

图2  （a）在无限远校正光学系统的显微镜中，图像由物镜和管镜头形成。(b) 通过在物镜和管镜头之间插入由两个消色差透镜组成的额外中继系统，形成了一个共轭瞳孔。在这个位置放置液态变焦透镜ETL和补偿透镜可以实现轴向聚焦，而不会改变数值孔径或放大倍数。将液态变焦透镜ETL和补偿透镜水平放置可以避免由于重力引起的透镜膜变形。感谢Fabian F. Voigt提供的信息。

对于大多数三维显微镜应用，需要能够增加和减少物镜的工作距离。一些液态变焦透镜（ETL）仅限于在正焦距限制之间进行调节。在这种情况下，需要将它们与固定的负偏移透镜（OL）配对，以将光束从收敛变为发散。

 

当通过显微镜的目镜观察时，人类观察者会移动他们的头部，直到他们的眼睛位于显微镜的出瞳位置，出瞳通常可见为似乎悬浮在目镜上方的小亮点。当眼睛位于出瞳位置时，它们对微观图像有非常好的概览，并且作为“集成”的人类聚焦设备表现非常佳。理想情况下，ETL/OL组合也应该放置在这样的瞳孔位置，但使用标准目镜的出瞳通常并不有益：典型的管镜头和目镜组合的高中间放大倍率严重限制了可用的聚焦范围。这是因为调节范围与显微镜放大倍率的平方成反比。

 

一个更好的选择是使用定制的中继系统（图2）创建一个与显微镜物镜共轭的瞳孔位置。需要小心地将ETL/OL组件放置在光路的垂直部分（图2b）。否则，由于透镜膜因重力引起的变形，图像可能会表现出不需要的像差（特别是彗差）。在具有非常模块化设计的新一代研究显微镜中，集成这样的中继系统通常很简便。

应用示例：宽场显微镜

对于视觉使用来说，在聚焦时视场（FOV）或放大倍数的变化可能会造成混淆（因为它的视觉外观对应于变焦效果）。对于小的聚焦增量（几um），这是可以容忍的，否则，这种效果会变得令人烦恼。在这种情况下，将 ETL/OL 组合放置在共轭瞳孔位置是必要的。在大多数显微镜中，必须插入一个包含中继光学元件和 ETL/OL 组合的定制模块到光路中。在典型的立式显微镜中，停止位置位于物镜内部，无法访问，因此需要一个中继系统。然而，在倒置显微镜中，共轭瞳孔通常由显微镜体内的光学元件形成，在某些类型的显微镜中，这个瞳孔是可以访问的，并且位于光路的垂直部分，这使得它非常适合插入基于液态变焦透镜的聚焦系统。图 3 所示即为这样的显微镜，即 1980 年代的蔡司 Axiovert 35。

图3  Axiovert 35显微镜的光路。ETL/OL组件可以放置在瞳孔，而无需插入额外的中继系统。TL:管镜头

图4  带有移除侧盖以访问瞳孔的 Axiovert 35 显微镜。图3中突出显示了一些光学组件

图5  在共轭瞳孔位置插入ETL/OL组件。液态变焦透镜ETL和OL安装在连接到光轨上的柱子上。插图:通过寻找相位环的清晰图像可以找到共轭瞳孔的位置。

结论

结合使用 40x NA 0.6 物镜（Zeiss LD Achroplan 40x / 0.6 Korr Ph2），可以实现高达 120 um的离焦范围（校正环被设置在固定位置）。图 6 显示了使用液态变焦透镜聚焦拍摄的一组花粉粒（上皮荧光模式）的 z-stack 样例图像。

图6 通过一组花粉粒进行基于液态变焦透镜的聚焦。图像范围从名义成像平面的 -30 um到 +25 um 。由于液态变焦透镜位于共轭瞳孔的位置，因此没有放大倍数的变化。比例尺：100 um

应用实例:共聚焦显微镜

共聚焦显微镜是重要的显微镜技术之一，在细胞生物学、单分子物理学等领域有着广泛的应用。

 

标准的共聚焦显微镜是高度集成的系统，无法在大部分光学路径中访问或插入光学元件。根据具体的显微镜型号，插入ETL/OL组件有多种解决方案。一种可能性是在显微镜台的滤光轮中安装一个定制的滤光立方体，如果滤光立方体对共聚焦成像不是必需的，可以将ETL/OL组件安装在这个滤光立方体中。或者，液态变焦透镜可以安装在一个中继系统中（图7）

 

我们使用的显微镜（图8）是带有共聚焦单元（Yokogawa CSU X1）和ccd相机的转盘共聚焦显微镜，这些设备安装在奥林巴斯IX-71的侧面端口上。这种显微镜配置允许插入一个包含液态变焦透镜ETL和OL的改装原始滤光立方体到滤光轮中，而无需对显微镜进行大量修改。在操作过程中，只需将滤光轮旋转到一个空位置，就可以简单地将液态变焦透镜ETL从光学路径中移除。

图7  在典型的倒置激光扫描显微镜中实现基于液态变焦透镜的聚焦有三种不同的选项。

（1） ETL/OL可以像压电驱动的聚焦装置一样，放置在显微镜物镜和物镜转盘之间。

（2） 如果可能的话，液态变焦透镜ETL和OL可以安装在一个定制的滤光立方体中。这两个选项都有一个共同的缺点，那就是在聚焦过程中可能会有显著的放大倍数变化。

（3） 为了避免这种情况，可以在共聚焦扫描单元和显微镜台之间插入一个中继系统。为了获得非常佳的系统性能，液态变焦透镜ETL应该位于光学路径的垂直部分——否则，由于重力引起的不对称变形可能会导致可调膜的图像质量下降。

图8  在共聚焦显微镜中实现液态变焦透镜ETL和OL的实施。(a) 旋转圆盘单元安装在显微镜架的左侧端口。蓝色CCD相机用于成像。控制液态变焦透镜ETL的电流转换器由函数发生器控制。ETL/OL组件安装在定制的滤光片转盘(b)中，并插入滤光片转盘(c)。滤光片转盘重新插入到显微镜架的目标转盘正下方的位置。

结论

结合使用40倍NA 1.3物镜（奥林巴斯UPLFLN 40XO），可以实现60 um的Z轴范围。 图9显示了一个花粉粒（100 um直径）的Z轴堆叠的单个切片。

图 9 花粉粒的Z轴堆叠（100 um直径），覆盖范围为60um。相对于第1张图像的Z轴位置已标示。比例尺：50um

图 10   图6所示数据的Max强度投影。

应用实例:双光子显微镜

由于在散射介质中具有优异的成像能力，双光子激发是一种非常适合于组织深层荧光成像的技术。结合神经活动的功能性指标和活体成像协议，双光子显微镜是一种标准方法，用于记录活体小鼠大脑深处数十至数百个神经元群体的活动。神经元分布在一个体积中，采样单一焦平面只能提供局部网络中发生的整体活动的线索。因此，需要快速且简单的3D显微镜技术——使用液态变焦透镜提供了一种非常简单直接的方法。实际上，液态变焦透镜和双光子显微镜是理想的组合，原因如下：

（1） 在大多数双光子显微镜中，可以通过仅在激发路径中实现光学聚焦方案来实现轴向扫描。这是因为双光子显微镜中使用的非线性激发过程，只能在焦点处激发荧光团。通过改变激发光束来轴向和横向移动焦点，对于3D双光子激光扫描显微镜来说是足够的。

（2） 激发激光器在近红外波长下工作，在我们的显微镜中为850 nm。长波长允许容忍波前畸变，这些畸变在可见光波长下会严重降低图像质量。

（3） 激发激光的小光谱带宽（10 nm FWHM）限制了非色散ETL/OL组合可能引入的色差影响。

（4） 对于大多数测量功能性细胞活动的生物学应用来说，安装在物镜附近的ETL/OL组件引入的视场大小变化不会干扰测量。为了记录功能数据，激光必须在一段时间内反复指向同一组细胞。如果由于放大倍数的变化导致细胞间隔变远，可以选择相应的点进行扫描。

装置

与定制双光子显微镜结合使用的装置如图11所示。

图 11  在双光子显微镜中实现ETL/OL组件的安装。液态变焦透镜ETL和OL安装在与显微镜检测系统相连的定制物镜支架上。使用可移动的二色分光片DC，发射的荧光可直接被导向背景中的检测系统。RMS螺纹位于支架底部，允许奥林巴斯LUMPlanFl/IR 40x NA 0.8水浸物镜连接。(b) 液态变焦透镜ETL和OL安装在定制架内的剖面图。(c)荧光素溶液中双光子激发焦点的直接可视化。焦点（绿色长形斑点）可以在与40x物镜结合使用时在高达700 um的范围内移动。

结论

通过将液态变焦透镜的焦距调节在50至200 mm之间，实现了高达700 um的轴向聚焦。物镜的工作距离(标称为3.3 mm) 相应变化为2.8 ~ 3.41 mm。对于大多数成像应用来说，一个更小的范围就足够了。

图 12 轴向焦点偏移（40x物镜，-100 mm偏移透镜）对施加于液态变焦透镜的控制电流的依赖性。这组校准值被用作查找表，以聚焦到期望的位置。

图13 在不同轴向焦点位移下，无ETL (左图)和有ETL的重新聚焦的花粉颗粒图像，用显微镜的电动z级进行测量。请注意放大倍数/视场（FOV）大小的变化。比例尺：5 um

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使用Optotune液态变焦透镜的出版文献

1.· B. F. Grewe, F. F. Voigt, M. van’t Hoff, and F. Helmchen, “Fast two-layer two-photon imaging of neuronal cell populations using an electrically tunable lens,” in Biomedical Optics Express 2, 7, 2035- 2046 (2011).

(http://www.opticsinfobase.org/boe/abstract.cfm?uri=boe-2-7-2035)

2.· B. Kemper, R. Schubert, S. Dartmann, A. Vollmer, S. Ketelhut, and G. von Bally, “Improved quantitative phase contrast in self-interference digital holographic microscopy and sensing dynamic refractive index changes of the cytoplasm using internalized microspheres as probes,” in SPIE Three Dimensional and Multidimensional Microscopy: Image acquisition and Processing XX, Proceedings Vol. 8589 (2013).

http://proceedings.spiedigitallibrary.org/proceeding.aspx?articleid=1656293

3.· F. O. Fahrbach, F. F. Voigt, B. Schmid, F. Helmchen, and J. Huisken, “Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens,” in Optics Express 21, 18, 21010-21026 (2013).

(http://www.opticsinfobase.org/oe/abstract.cfm?uri=oe-21-18-21010)

4.· J. L. Chen, O. A. PfäFFLi, F. F. Voigt, D. J. Margolis, and F. Helmchen, “Online correction of licking-induced brain motion during two-photon imaging with a tunable lens,” in Journal of Physiology 00.00, 1-10 (2013).

(http://jp.physoc.org/content/early/2013/08/29/jphysiol.2013.259804.abstract?sid=52004717-fd2e- 4c39-8c6a-24cc2df0645a)

5.· J. M. Jabbour, B. H. Malik, C. Olsovsky, R. Cuenca, S. Cheng, J. A. Jo, Y.-S. L. Cheng, J. M. Wright, and K. C. Maitland, “Optical axial scanning in confocal microscopy using an electrically tunable lens”, Biomedical Optics Express 5, 2, 645-652 (2014). http://dx.doi.org/10.1364/BOE.5.000645