阻抗分析在微流控中的应用

正文

阻抗分析在微流控中的应用

一． 简介

人类对自动化和高效率的追求，让微流控技术获得很多微型生物化学分析领域专家们的青睐。微流控意为在微型设备上对流体的控制、操作和处理。微流控技术属于一种底层技术，融合了化学、流体物理、微电子、新材料等多门学科知识。微流控芯片成为微流控技术的核心元件，它将原本需要在实验室进行的样品处理、生化反应和结果检测等关键步骤汇聚在一张微小芯片上进行，被业界誉为“芯片实验室”。微流控芯片具有强大的集成性，能够同时并行处理大量不同样本，具备分析快、耗能少、污染低等特性，因此被广泛应用在生物医学研究、药物合成筛选、司法鉴定等多个领域。

生物医学的发展对细胞和亚细胞成分（细胞核，RNA，DNA）的电阻抗谱测量提出了更高的要求。目前有三种常见的方法来观察微流控通道中细胞的大小和速度。

第一种是基于光学方法的细胞计数。它需要使用激光照射微流控通道中已经标记好的细胞，并检测产生的散射或荧光。除了使用的染料可能有毒或昂贵之外，维护和设置激光及检测系统同样会限制该技术的便携性和耐用性。

第二种是基于图像的细胞计数。它依赖于高速相机的使用。在使用其它设备将细胞分类到不同通道之前，您需要通过进行图像处理来判断细胞的大小。普通摄像机的帧速会限制其检测速度，每记录一帧可能需要 200 微秒的时间。

第三种选择是阻抗细胞计数法。它具有快速的响应时间，无需标记且可集成分类操作。该技术基于监控细胞通过微流控通道中两个电极对时产生的介电特性的变化。其中一种方法使用锁相放大器，和匹配的电流放大器来测量微流控通道中两个电极对之间电流的变化，具体连线如图2所示。由于实验中使用了差分电流测量的方法来测量电流的变化，来自流体的背景信号会在很大程度上被抑制。这使得测量到的电流信号更清晰，方便您从中推断出细胞的大小和速度。

典型的微流控实验装置如图1所示，细胞悬浮液经过注射泵通过聚四氟乙烯管道进入微流控芯片。悬浮液流速一般保持在 0.5 µL/min左右。由压力控制器提供压强使得捕获孔位内外两侧压强不同从而进行细胞或测试微粒的捕获。而后由数字锁相放大器（DLIA）提供 1Vpp 的激励信号对捕获的细胞或测试微粒进行激励而后测量微流控芯片中反馈的电流信号。经由电流放大器转换为电压信号方便数字锁相放大器测量。然后在计算机（PC）端收集数据并计算细胞的阻抗信息。

图1 （a）微流控阻抗测试的整体架构图 (b).微流体装置的显微照片（比例尺为100 μm）

本文介绍了，约翰霍普金斯大学化学与生物分子工程系的研究成果[1]，实现了非光学EIS技术来动态跟踪一个混溶微流控液体界面的位置。此方法利用两种不同的电极阵列：上游平行点电极阵列在液体界面极化和诱导电动流动，下游一系列交错电极动态测量微通道表面的EIS。实验表明，阻抗的大小(|Z|)对液体界面的位置很敏感，并可以用于跟踪界面运动响应电动力学诱导的流体流动。科学家们提出，该系统的变化可能在电动力学、流变学、生物分子检测和微流控混合应用中用于非光学监测微流控界面的动力学。

上海昊量光电设备有限公司代理的德国Sciospec公司的EIT设备，为国内外科研院所提供了多种类型的设备，包括单通道、多通道的EIS设备和不同电极的EIT设备。

二． 理论基础

交流电场长期以来一直被广泛用于操纵微流控系统的流体含量。当电场在带电表面或非中性液体区域内施加时，会产生能驱动流体流动的电应力。在液体中，当一个场垂直应用于带电表面（如电渗透）或穿过具有电性能空间梯度的流体区域（如电热流）时，就会发生这些电动流动。最近，在两种混溶水电解质之间形成的层流液体界面附近发现了一种新型的电动流。这种现象被称为流体介电泳(fDEP)，它描述了使用外部交流电场通过微通道使层流液体界面偏转的能力。该界面是使用微流控t通道装置创建的，其中两个流体被迫并排流动。每种液体具有不同的电导率(σ)和介电常数(ε)，因此在它们的界面上存在较大的电错配。fDEP运动是利用由集成在微流控通道表面的平行点电极阵列产生的垂直电场产生的(图2a)[2]。对于受时变单色电场影响的液体界面，位移与界面极化率因子K（ω）的实部成正比，K（ω）是场频（ω）、电导率和介电常数的函数：

是典型的麦克斯韦-瓦格纳电荷两种液体界面处的弛豫时间刻度。如Eq所示。由于界面极化(如充电)是由导电和介电充电共同驱动的，所以位移是两者电学性质的函数流体和交流电场频率。例如，在100 kHz数量级的频率下，界面位移的大小仅由两种共流流体之间的电导率差异决定，我们在这里将其定义为界面电导率(σ2−σ1)。然而，在高频(通常为>10MHz)下，位移是由界面介电常数（ε2−ε1）驱动的。最后，在中频时，界面行为对电学和电介质的差异都很敏感，由于fDEP的低频和高频特性，如果一个流体相具有更大的电导率（σ1>σ2），并且相邻流体具有更大的介电常数（ε2>ε1），界面位移的方向将在临界频率反转，并存在没有观察到界面位移的特征交叉频率（交越频率（COF））。当接口的极化率因子为零时会发生这种情况，可以表示为：

在低频时，高导电流体通过流动通道进行移位（图2b）。在交越频率（COF）处，界面上的净电荷为零，没有观察到位移(图2c)。最后，在交越频率（COF）的上方，界面在相反的方向上发生位移(图2d)，低导电的高介电流体在通道上发生位移。 接下来，我们讨论了利用EIS非光学测量位移方向和幅度的实验装置[3]。

图2 共聚焦显微图与两个嵌入式电极阵列。(a)两种具有不同电学特性的共流流体被驱动到一个微流控t通道装置中。每个入口通道（75米宽）与一个150米宽的主通道汇合，形成一个尖锐的液体界面。一个流具有较大的电导率（绿色），而相邻的流（红色)具有较大的介电常数。主通道有两个嵌入式电极阵列，位移电极驱动液体电界面，传感电极测量局部阻抗。(b)A1MHz交流电场作用于位移电极，将高导电流（绿色）置换到低导电流（红色）中，虚线白线表示原始界面位置。(c)在交越频率（COF）为6.2MHz时，接口在现场不会发生偏转。(d)在20MHz时，高介电流（红色）移入低介电流（绿色）。

三． 实验

3.1 实验装置

实验设计需要一个层流界面和两种不同类型的电极阵列来置换并随后检测界面的位置。我们使用了一个微流控的“t通道”装置来创建液体界面。使用低成本的恒压源流系统将两个流体流供应到微流控装置。微流控装置采用标准软光刻和微加工技术和微加工技术。采用湿式化学蚀刻法制备了微通道电极。玻璃盖玻片(50×30mm，编号1，飞雪科学)用电子束蒸发法涂上2nm的铬和50nm的金。盖玻片用光刻胶(Shipley1813)形成图案，暴露的金属用金和铬蚀刻剂蚀刻。然后将得到的电极图案对齐并结合到软光刻制作的Tclanel器件上。为了制造该器件，使用SU-8 3050 光刻胶(MicrochemCorp.)将“t通道”图案光刻制作到硅片上。将聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体和固化剂的10：1混合物倒在晶圆片上，在85◦C下烘烤30min。将PDMS从晶圆上轻轻剥离并从模具上切下。用0.75 mm直径的活组织切片打孔器对液体进行穿孔(Ted Pella, Inc.)。然后将电极图案的覆盖物暴露在氧等离子体(Jepight，型号42A)中，使用手持特斯拉线圈暴露PDMS微通道(电子技术产品公司。模型BD-20)和两种衬底立即在倒置显微镜下对准和密封。组装的装置包括宽150米、高65米的主流通道、上游位移（平行点）和下游阻抗（45◦交错）电极阵列（图2）。为了进行实验，使用平行点电极阵列对流体界面进行电场作用，并在不同的电场频率下强迫fDEP移位(图2b-d)。当流体离开第一个位移阵列时，界面应力停止了。由于惯性对流动的影响很小(Re < 1)，流体界面在退出fDEP数组后，立即保持固定在移位位置。然后，我们通过使用第二个交错电极阵列测量阻抗的大小来确定偏转位置[1]。

3.2实验物品介绍

液体界面由两种流体组成，每种流体具有不同的电导率(σ)和介电常数（ε）。当被迫以低雷诺数并排流动时，这两种流体形成了一个在它们之间有很大的电不匹配的界面。使用低成本的流控制器以恒定的流量(10L/min)注入设备，该控制器配备了外部加压的低温小瓶。我们用不同的AlexaFluor荧光染料标记每一种流体，以使用共聚焦显微镜准确成像界面位置。

如图2所示，电界面是由最左（绿色）1xPBS溶液（σ1=0.29mS/cm；ε1=78）与10ng/mL的Alexa流体488（Invitrogen）构成的。最右边（红色）高介电流（σ2=19μs/cm；ε2=110）由0.8M6-氨基己酸（西格玛-奥尔德里奇）(AHA)组成，标记有10ng/mL的Alexa流体594（Invitrogen）。AHA是一种水溶性两性离子，用于增加水溶液的介电常数。在荧光标记之前，用1g/mLDowexMr-3(Sigma)离子交换树脂抛光AHA溶液，以去除微量盐并降低溶液的电导率。使用先前发表的方法测量了该电解质系统的交越频率（COF），发现其交越频率（COF）为6.2MHz。

3.3阻抗测量

我们利用上游并行点阵列驱动fDEP流通过通道，并利用下游45°交错阵列作为阻抗传感器。平行点电极轴向间隔20m，并对称桥接微通道的宽度。我们使用带有尖锐点的电极将电场聚焦到电极的尖端，并沿着主流通道壁增加与PDMS和玻璃基板的接触。一个函数发生器(RigolDG4102)被连接到fDEP电极上，并传递一个交流电场来取代跨通道的接口。下游阻抗电极被交错，并相对于流动方向定位在45◦的角度，以最大限度地提高阵列对界面位置变化的敏感性。将阻抗谱仪(SciospecISX-5)连接到阻抗电极阵列上，并用于测量阻抗的大小作为界面位置的函数。对于所有的阻抗测量，对电极阵列施加50mV的正弦调制交流电位，并在100kHz到10MHz的激励频率范围内测量阻抗的幅度和相位角

四． 量数据分析

4.1.电动位移过程中的成像界面位置

图2b-d描述了在三个不同的场频率(1MHz、6.2MHz和20MHz)的位移电极上施加10-V峰对峰(Vpp)电位时，界面在fDEP电极阵列长度上的界面运动的俯视图。当电场频率为1MHz时，导电PBS（绿色）流穿过界面发生位移（图2b）。当施加交越频率（COF）(6.2MHz)时，导电力和介电力都相等，当它通过电极阵列时，界面保持固定(图2c)。最后，在频率高于交越频率（COF）(20MHz)时，偏转方向反转，高介电流（红色）通过微通道发生位移（图2d）

4.2 利用阻抗谱法表征电动界面流

由于流体的界面驱动运动在离开位移电极阵列时停止，因此可以使用下游阻抗电极阵列准确地确定界面的位移位置（图3）。图3a-c所示的俯视图显示，当界面处于低或高频电场时，高导电低介电PBS或低导电高介电AHA分别以低场和高场频率覆盖传感电极。

观察的三维结构数据脸部用的流场,2 d共焦显微图捕获超过三个不同的阻抗电极阵列电场频率:1,6.2和20 MHz(图3)位移电极薄平面电影(∼52海里)和局限于微通道表面,负责驱动流动的电应力被定位在微通道的表面附近。为了满足质量守恒，这种局部电动流动被通道顶部的压力驱动回流抵消，产生了一个“倾斜”的界面，如图3中的二维共聚焦显微图所示。由于阻抗电极阵列也局限于微通道表面，阻抗测量只对离电场能够穿透液体域的表面非常接近的流体域的电特性敏感。因此，fDEP产生的界面位置的差异会导致阻抗传感器附近流体的局部电导率和介电常数的变化。

为了确定测量界面位置的最佳阻抗条件，我们首先确定了上游fDEP位移如何在一个阻抗激发频率范围内影响下游阻抗。通过PBS和AHA的共流溶液创建一个电界面，然后在交越频率（COF）低于(1MHz)和高于(20MHz)的频率，当没有应用场时（例如交越频率（COF）的位置）偏转。对于每个接口位置，我们进行了从100kHz到5MHz的阻抗频率扫描，以确定不同界面位置的阻抗大小（图4）。

在1MHz的界面交越频率（COF）以下，fDEP电极极化，并迫使高导电（绿色）流在阻抗电极阵列上覆盖更大的区域。相反，当我们在交越频率（COF）以上应用高频时，高介电流和阻抗传感器暴露在电导率较低的流体中。阻抗数据与界面位置在阻抗电极附近产生的电变化相一致。当高导电-低介电PBS覆盖大量阻抗电极阵列时，阻抗下降，而当低导电-高介电AHA流穿过阻抗电极阵列时，阻抗则相反。

由于界面位置不受交越频率（COF）处电场的影响，因此交越频率（COF）处的阻抗大小与不施加位移场时相同，因为界面在交越频率（COF）处没有位移。如图4所示，在阻抗频率为∼500kHz时，界面偏转对阻抗(|Z|)的幅度变化最大。在这些实验的基础上，我们在所有后续实验中以500kHz的频率测量了|Z|。

图3。在上游位移电极上施加的三种不同电场频率下，在阻抗传感电极上方拍摄的界面位置的自上而下共聚焦显微图。下面描述了一个放大的3D共聚焦z堆栈，每个自上而下的显微图。对于每个图像对，当没有应用字段时，白色虚线突出显示界面位置。(a)在1MHz的场频下，高导电流（绿色）被驱动穿过通道表面。相应的三维共聚焦堆栈显示，覆盖在传感电极表面的导电绿色流体的增加。(b)采用交越频率（COF），6.2MHz，液体界面保持固定。(c)位移方向在20MHz时逆转，高介电流移位为低介电流。三维图像显示的方向相反，导致覆盖阻抗电极的导电流减小。

4.3 利用阻抗谱法确定界面位置

在阻抗激发频率固定在500kHz的情况下，我们接下来使用上游位移电极阵列测量了三个不同施加电压(5Vpp、10Vppvpp和15Vpp)的|Z|作为功能界面位置。对于每个施加的电压，fDEP频率被连续扫描从1到20MHz，然后回到1MHz，同时测量下游阻抗阵列的|Z|。如图5所示，当界面以交越频率（COF）为中心时，三种电压下的|Z|均为32.5k。

高导电的PBS流覆盖了阻抗传感器表面的大部分，在5Vpp的外加电压下，阻抗从25k降低到15k。当fDEP频率增加到交越频率（COF）以上时，高介质流体覆盖传感器表面的大部分，|Z|增加到45k.当电界面受到较大的位移电压的影响时，阻抗也会受到影响。

这种增加在高频率(>COF)尤其明显，因为低导电、高介电AHA缓冲器覆盖了阻抗传感器的更大区域。为了可视化界面，我们捕获了在5、10和15Vpp电压下施加20mhz交流电场时界面的三维共聚焦显微图。如图5的显微图所示，随着施加电压的增加，AHA流（红色）覆盖了一个更大的电极面积。虽然在高频时阻抗随着电压的增加有很大的变化，但三个|Z|数据集在低频时的影响不那么大（

如图6b所示，我们可以看到两种流体系统在相同的无量纲阻抗|Z|*结束，但它们的COF不同，并随着界面电导率的增加而增加，这与之前的fDEP实验一致。

图4 不同fDEP界面位置的阻抗|Z|相对于应用激励频率的大小。为了确定阻抗谱仪的最佳频率，我们进行了三次扫频。当位移电极被1MHz施加时，高导电-低电介质（绿色）流覆盖了更多的阻抗传感器电极区域，阻抗幅度减小。当施加20MHz电场时，高介电-低导电（红色）流占据较大的传感电极面积，阻抗增加。当场关闭并应用交越频率（COF）时，阻抗的大小保持不变。

图6 在两种不同的界面电导率差异下，500kHz激发频率与fDEP频率的阻抗。(a)不同应用频率下的阻抗大小，1-20MHz。界面电导率较小的界面的测量阻抗较大。(b)两个系统的阻抗大小都被呈现为无量纲，以比较两个数据集。阻抗测量能够非光学地确定交越频率（COF）随着界面电导率的增加而增加。

五．结论

本实验采用的是利用阻抗谱检测电动力学位移液体界面的方法。通过高于和低于临界交越频率（COF），可以控制在层流界面的两种流体在微通道内顺流和偏转流动，再通过配套的阻抗电极阵列来测量偏转界面的位置。此方法能够检测界面位移，其分辨率与共聚焦显微镜的实验一致。如果配套对应的等效电路模型来解释这种影响，并准确预测可以非光学测量界面运动的检测极限。

本文提出了一种利用阻抗谱检测电动力学位移液体界面的新方法。利用交流电场，我们使用fDEP强迫层流流体界面通过微通道进行偏转，然后使用下游阻抗电极阵列测量偏转界面的位置。欢迎大家来电咨询。

相关文献：

[1] Nicholas Mavrogiannis, Xiaotong Fu, Mitchell Desmond, Robert McLarnon,Zachary R. Gagnon，Monitoring microfluidic interfacial flows using impedance spectroscopy. ScienceDirect. Sensors and Actuators B 239 (2017) 218–225.

[2]  M. Desmond, N. Mavrogiannis, Z. Gagnon, Maxwell-wagner polarization and frequency-dependent injection at aqueous electrical interfaces, Phys. Rev.Lett. 109 (2012) 187602.

[31]  N. Mavrogiannis, M. Ibo, X. Fu, F. Crivellari, Z. Gagnon, Microfluidics made easy: a robust low-cost constant pressure flow controller for engineers and cell biologists, Biomicrofluidics 10 (2016) 034107, http://dx.doi.org/10.1063/1.4950753.

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