在光学显微镜中，不言而喻，只能从标本被照亮的部分获得信息。当然，如果照明在空间上不均匀，那么这种不均匀性将使图像数据产生偏差。然而，照明场的有意进行特殊配置是过去25年中出现的许多提高荧光显微镜的空间分辨率技术的基础。在文本中，我们将介绍固态光源的输出特性以及它们如何传播到成像应用中。
固态光引擎的空间光输出特性
1. 固态光源：激光器和LED
光引擎是一个紧凑的固态光源阵列，在统一的控制基础设施下运行，并馈入统一的光输出路径（图1）。阵列的元件可以是LED或激光器或两者的混合，具体取决于预期应用的要求。在本文中，我们将把激光器的考虑限制在半导体激光器上，半导体激光器的总体尺寸与LED相似，允许它们被纳入阵列中，而无需从根本上重新设计支持基础结构。
实际上，LED和激光器在三个重要方面有所不同：
（1） 光谱分布（图1）
（2） 光输出生成效率（图2）
（3） 输出空间分布（图3）。
激光的光谱带宽较窄（图1），这在荧光显微镜中并不特别重要，因为荧光染料和荧光蛋白的光谱带宽通常大于LED或激光。相反，是输出空间分布，方便地表示为光学扩展量（étendue）[1]，这主要区分LED和激光器的下游应用。一般来说，光学扩展量是器件的发光表面积与来自该面积的光的角发散度的乘积。因此，激光器的光学扩展量值比LED小得多（表1）。这使得LED主要适用于宽视场荧光显微镜，主要用于观察二维样品，在较大的视场范围内，其空间分辨率高于衍射极限（>200 nm）。激光器更适用于需要高辐射强度的应用（表1），如共聚焦显微镜，单分子定位显微镜和超分辨率显微镜。
图1所示。由4个固态光源阵列组成的光引擎示意图。在实践中，根据应用需求，源的数量可以在2-21之间。光源可以是LED（产生光谱输出，如右上所示）或激光（产生光谱输出，如右下所示）。可以对LED进行滤波(F)以选择LED光谱输出的子集。
图2. LED和激光器的光输出与驱动电流关系。LED通过半导体的PN结产生光输出。半导体激光器是类似的，除了光的产生被限制在半导体内的一个小腔内（图4），在那里它被放大，导致在大多数驱动电流水平具有更高的输出功率。
图3. LED光输出的朗伯空间分布。荧光显微镜应用通常利用光输出ϴ从0到60°。
用于荧光显微镜应用的单个LED光源通常具有1mm×1mm的发光表面。从该表面发出的光具有朗伯空间分布（Lambertian spatial distribution）（见图3），这些光必须被准直并z终聚焦以用于显微镜。显微镜的光学扩展量限制了可以有效利用的朗伯输出分布的多少。通常，这是一个60度半角的锥形，代表了LED总输出的大约90%。半导体激光从在多层半导体结构中形成的谐振光学腔中发出光（见图4）。激光二极管的发光面积大约比LED小4个数量级（0.0001mm2对比1mm2），使其能够在更小的发散角内提供类似的功率输出。激光腔的横向宽度（发射区宽度，见图4）决定了激光是单模（宽度<10μm）还是多模（宽度>50μm）。就应用而言，单模和多模半导体激光器在输出功率和角度发散之间代表着一种权衡。
图4. 法布里-珀罗（FP）半导体激光器示意图。整机尺寸一般为1000µm×500µm×200µm（长×宽×高）。对于单模激光器，发射区宽度小于10 μ m，对于高度为1 μ m的多模激光器，发射区宽度小于50 μm。
除了高辐射强度和小光学扩展量（见表1）之外，激光源的光输出是相干的，而LED的光输出则不是。当激光的相干光被光学粗糙表面反射而随机化时，结果就会产生激光散斑（见图5）。在需要均匀照明场的应用中，激光散斑显然是不利的。在这种情况下，可以对激光输出应用各种技术来扰乱其时间或空间相干性[2]。另一方面，激光散斑可用于测量表面粗糙度或散射粒子的运动。这些应用中值得注意的是激光散斑对比成像（LCSI），它用于测量组织中的血液灌注[3]。
图5.（左）由ZIVA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）输出的488nm激光产生的激光散斑图案。（右）相同的488nm激光输出后，通过一个旋转式散斑消除器。
1. 液体光导（LLG）和光纤输出
液体光导和光纤提供了从光引擎向下游光学分析系统（如显微镜）传递光输出的柔性通道。液体光导通常具有比光纤更大的横截面积和更大的角度接受范围（数值孔径）。因此，光纤通常（尽管不专用于）与激光光引擎配合使用，而液体光导与LED光引擎配合使用。LED和激光光引擎产生的光的角度分布传播特性展示在图6中。图6（a）显示了表征方法。根据光传输线出口与投影屏幕之间的已知距离，通过相机检测到的投影辐射光强度值被转换为数值孔径（NA），通过应用公式NA = n.sinθ。图6中的数据展示了几个显著特点。如预期的那样，基于第1节中描述的特性，通过液体光导传播的LED光引擎的角度分布比通过多模光纤传播的激光光引擎的角度分布更宽（比较图（b）和（c）与图（d）和（e））。在图（d）和（e）中明显可见的不同激光辐射角度分布差异归因于源激光的多模输出。通过添加下游的光束整形光学元件（图（f）和（g）），获得了消色差的角度分布。这一特性对于使用多色荧光显微镜定量确定细胞和组织中分子共定位至关重要[4]。
图6.（a）角度光分布表征方法。通过Thorlabs DCC1240M cmos相机捕捉投影的辐射光分布。
（b）由SOLA V-N LED光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）产生的未过滤白光（380–760 nm）通过直径为3毫米或5毫米的液体光导传输后的角度分布。
（c）由多源SPECTRA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）产生的过滤LED和激光光通过直径为3毫米的液体光导传输后的角度分布。紫色LED = 395 nm，青色LED = 475 nm，绿色LED = 555 nm，黄色 = 575 nm，均具有25 nm带宽。激光中心波长为637 nm（红色）和748 nm（近红外）。
（d）由CELESTA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）产生的光通过直径为1.5毫米（NA = 0.39）的多模光纤传输后的角度分布。激光中心波长为405 nm（紫色）、477 nm（青色）、545 nm（绿色）和639 nm（红色）。
（e）由CELESTA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）产生的光通过方形0.4毫米×0.4毫米（NA = 0.22）的多模光纤传输后的角度分布。激光中心波长为405 nm（紫色）、477 nm（青色）、545 nm（绿色）和639 nm（红色）。
（f）与（e）相同，但光纤远端的光输出通过Thorlabs F950多模准直器。
（g）与（e）相同，但光纤远端的光输出通过Lumencor临界落射照明器（另见图8）。
3. 荧光显微镜照明
柯勒照明（图7）自1893年引入以来，一直是宽场落射荧光显微镜的主要照明方法[5]。柯勒照明开发的主要动机之一是来自白炽灯灯丝的照明不均匀性，或者是放电灯弧的漂移或闪烁。柯勒照明通过将光源置于成像样本平面的焦点之外（图7）来消除这些问题。像激光和LED这样的固态光源本质上更具空间均匀性，使得实施临界照明成为可能，在临界照明中，光源在图像平面上聚焦（图7）。LED提供的柯勒照明在样本平面上的照射强度为1-100 mW/mm²，这对于宽场荧光显微镜来说已经足够。然而，柯勒照明相对效率较低，因为它并没有传播光源发出的全部面积或全部角度分布的光。对于像单分子定位显微镜（SMLM）这样的特殊成像技术，需要更高水平的照射强度，大约为10,000 mW/mm²（1 kW/cm²）[6]。这可以通过使用临界落射照明器实现，该照明器将激光光引擎输出的超过50%的输出功率传递到样本平面（图8）。临界落射照明器产生均匀的、高照射强度的照明，其覆盖面积与用于成像的scmos相机传感器的面积相匹配。
图7. （A）柯勒照明和（B）临界照明的光学示意图。图A中的垂直虚线表示物镜的后焦平面。
图8. 使用CELESTA 光引擎成像的均匀荧光玻璃，该引擎通过800 µm直径的光纤耦合到安装在Nikon Ti/Ti 2显微镜中的临界落射照明器。使用Nikon 60 X/1.4 NA Plan Apo物镜和Andor Zyla 5.5（2560 x 2160像素）sCMOS相机拍摄图像。该图显示了摄像机沿着标记为红色的对角线轴记录的灰度值。右上角的插图显示了用Nikon 10 X/0.3 NA Plan Apo物镜成像的相同样品。
转盘共聚焦显微镜（Spinning Disk Confocal Microscopy, SDCM）利用临界照明来补偿因空间滤波以排除焦平面scmos外光而造成的光通量损失[7]。早期的SDCM实现使用单模激光通过单模光纤耦合到扫描头（东京横河电机）。然而，这种配置容易出现光学错位，并且常常在样本平面上产生不均匀的照明。通过ZIVA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）实现了显著改进。ZIVA光引擎整合了七个多模激光源，通过直接电子开关进行波长选择，无需像声光可调谐滤波器（Acousto-Optic Tunable filters, AOTFs）这样的辅助输出调制器。光引擎整合了光束整形和消散斑光学元件，产生与记录样本图像的sCMOS传感器尺寸布局相匹配的方形照明轮廓（见图5）。光输出通过精密设计的适配器耦合到横河CSU-W1扫描器，在样本平面上产生强烈且均匀的照明。通过省略AOTFs和耦合光纤等中间光学元件，提高了光通量，并且相对于单模激光发射，减小了系统的尺寸和成本。
全内反射显微镜（total internal reflection Microscopy, TIRF）通过将荧光激发限制在样本平面100 nm范围内，来消除焦平面外光的成像（相比之下， SDCM的z轴分辨率约为500 nm）。TIRF通常通过将激光聚焦到一个非常高数值孔径物镜的后焦平面上的一个约50μm直径的光斑来实现（“物镜TIRF”，[8]）。然而，通过将LED的输出通过一个环形掩模投影到物镜的后焦平面上，也可以有效地实现TIRF的照明[9]。物镜TIRF所需的高放大倍数物镜导致视野有限。这一限制可以通过使用波导TIRF来克服，在波导TIRF中，样本直接放置在高折射率的玻璃盖片上，该盖片通过边缘耦合连接由LED或激光提供的照明[10]。
总之，LED和激光在光谱分布、电光转换效率和输出空间分布方面有着明显的区别。其中，空间分布对于定义它们的应用非常重要。即便如此，激光应用和LED应用之间存在着相当大的重叠，这得益于能够在共同的控制和光学基础设计下容纳这两种类型的光源。z终，只有在仔细考虑空间分布的同时，结合针对分析和成像仪器需求定制的光谱和强度规格，才能构建出适当的照明，以服务于众多需要光子支持的生命科学和材料科学应用。
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参考文献：
[1] W Mönch (2015) Adv Opt Techn 4:79–85
[2] V Kumar, AK Dubey DS Mehta et al. (2021) Opt Laser Technol 141:107079
[3] W Heeman, W Steenbergen, EC Boerma et al. (2019) J Biomed Opt 24:1–11
[4] J Waters (2009) J Cell Biol 185:1135–1148
[5] A Nolte, JB Pawley L. Höring (2006) in Handbook of Biological Confocal Microscopy, (3rd Edition), JB Pawley (Ed) pp 126–144
[6] R Diekmann, M Kahnwald, J Rise et al. Nat Methods (2020) 17:909–912
[7] J Oreopoulos, R Berman, M Browne (2014) Methods Cell Biol 123:153–175
[8] A Yildiz, RD Vale (2015) Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top086348
[9] C Suckert, C Zosel, M Schaefer (2024) Cell Calcium 120:102883
[10] S Ramachandran, DA Cohen, R Lal et al. (2013) Sci Rep 3:2133
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