博览：2021 Nature量子增强非线性显微镜

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博览：2021 Nature量子增强非线性显微镜

技术背景：

光学显微镜是了解生命系统微观结构和动力学的有力工具。当前的先进显微镜有：以近原子分辨率对生物分子成像的超分辨率显微镜，快速探索三维活细胞的光片显微镜，用于神经网络光遗传学控制的高速显微镜等。然而，这些显微镜的灵敏度、分辨率和成像速度从根本上受限于散粒噪声。散粒噪声是由于光被量化为光子产生的。虽然通过增加照明光的强度可以减少散粒噪声的影响，但是对于许多应用于生物学的先进显微镜而言，由于光对生物活动的侵入，导致这种方法并不可行。众所周知，过量的光会干扰生物的功能、结构和生长，从而导致生物死亡。

几十年来，人们已经知道可以利用量子关联(quantum correlations)从用于光学测量的每个光子中提取更多信息。这使得我们不再需要纠结于信噪比和光强之间的平衡。实际上，出于这个原因，量子关联已经是提高激光干涉引力波探测器性能的常用手段。灵敏度提高的重要性促使人们将量子关联照明引入显微镜领域。量子关联也被用于红外光谱成像和光学相干层析的照明。然而，所有先前的实验使用的光强度比通常会出现生物物理损伤的光强度低 12 个数量级以上，并且远低于精密显微镜中通常使用的强度。因此，它们没有提供绝对的灵敏度优势(在没有量子关联的情况下，使用更高的光功率可以实现更高的灵敏度)。由于用于产生量子关联的方法的局限性、且量子关联产生后的脆弱性以及集成到精密显微镜中极具挑战性等，表明将照明强度提高到与高性能显微镜相关的水平是一个长期存在的挑战。

相干拉曼显微镜是一种非线性显微镜，可探测生物分子的振动光谱。它可以对化学键以极高的特异性进行无标记成像(特异性远高于使用荧光等可行的特异性手段)。这为研究广泛的生物活动(包括代谢活动、神经退行(nerve degeneration)、神经元膜电位和抗生素反应)提供了新的有力手段。

当前不足：

光损伤严重限制了相干拉曼显微镜的灵敏度和成像速度，为强大的前瞻性应用（如无标记光谱多路复用成像(label-free spectrally multiplexed imaging)）带来了障碍。最先进的相干拉曼显微镜已经受到散粒噪声的限制。因此，无法通过改进仪器来克服这个障碍。

文章创新点：

基于此，澳大利亚昆士兰大学的Catxere A. Casacio(第一作者)和Warwick P. Bowen(通讯作者)提出了一种结合量子关联照明的相干拉曼散射显微镜,可以打破散粒噪声限制，提高信噪比、灵敏度和成像速度。在对细胞内部进行成像时，信噪比提高了 35%。结合亚波长分辨率和高灵敏度(提升14%)，可以看到原本会被散粒噪声掩埋的生物特征。利用量子关联可以避免光致损伤。消除了相干拉曼显微镜和更广泛的高性能显微镜进一步发展的根本障碍。

原理解析：

（1）借助压缩态光场的光学测量可以突破散粒噪声极限，通过明亮压缩光源与相干拉曼显微镜结合，可以实现突破散粒噪声限制的成像效果。显微镜采取倒置结构，集成了传统明场成像和量子增强受激拉曼成像(如图1a)。选用近红外波长减小生物样品的激光吸收和光损伤。图1a左为泵浦光生成部分，中为受激拉曼散射生成及同时明场显微镜成像，右为斯托克斯光束检测及使用频谱分析仪进行信号处理。明亮压缩光源(bright squeezed light)详细结构见图2。

（2）使用专用的光学参量放大器在斯托克斯光子之间引入了量子关联关联，实现量子关联抑制噪声，从而提高显微镜的信噪比。关联抑制或“压缩(squeeze)”受激拉曼调制边带(sideband)频率下斯托克斯场上的噪声幅度（图 3a，虚线），同时保持拉曼信号强度不变（尽管时空模态变化会影响这一点）。

成像效果图:

a、拉曼位移为 3,055 cm-1 的 3 μm 聚苯乙烯珠子图像，样品上泵浦功率6 mW 。背景（绿色）无拉曼信号，受到测量噪声的限制，该噪声比散粒噪声低 0.9 dB，信噪比提高了 23%。
b、拉曼位移为2,850 cm-1的水性缓冲液中活酵母细胞（酿酒酵母）的图像。几个细胞器清晰可见。也可以看到可能是细胞膜或细胞壁的模糊轮廓，表明显微镜的分辨率约为 200 nm。在这里，测量噪声比散粒噪声降低了 1.3 dB，相当于信噪比提高了 35%。样本处泵浦功率约为30 mW 。 210 W μm-2 的泵浦强度低于可观察到的细胞损伤的强度。

（a、b 中的虚线矩形框显示用于确定测量噪声的区域，插图是明场显微镜图像。）

c、一系列图像，其中两个细胞以与 b 中相同的泵浦功率照射，但聚焦到大约高两倍的强度。仅曝光几秒钟后即可观察到可见光损伤（中间和底部图像）。

参考文献：Casacio, C.A., Madsen, L.S., Terrasson, A. et al. Quantum-enhanced nonlinear microscopy. Nature 594, 201–206 (2021).

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