荧光显微镜是一种核心的生物医学成像工具，可提供活体样本分子对比的高分辨率图像。生物系统中含有丰富的内源性荧光团，这些荧光团以一种方便、无标记的方式用于自荧光分子成像。
荧光寿命成像显微镜(FLIM)利用荧光的寿命特性，因其对分子环境和分子构象变化的高度敏感性而得到广泛应用。FLIM已广泛应用于研究细胞代谢的自荧光分子成像。自荧光分子的FLIM以非破坏性的方式提供了对细胞健康的独特见解，经常用于研究活体动物。
FLIM有利于探测荧光团的分子环境，以了解光强测量无法阐明的荧光团行为。图1中概述了时域和频域的FLIM测量，并在下面进行详细描述。简单地说，时域荧光寿命测量使用短脉冲光进行激发(相对于样品的寿命较短)，然后直接(即通过门控检测或脉冲采样)或使用时间分辨电子技术记录荧光分子的指数衰减如图1(a)及1(b)。另外，频域技术也可以测量荧光寿命如图1(c)和1(d)。这里，激励是连续的，随着时间的推移，振幅调制为正弦波。荧光信号的相位和振幅随激发波的变化而变化。通过绘制在一定调制频率范围内的相位变化，可以看到荧光团的相位延迟和振幅调制如图1(d)。得到的荧光正弦信号可以在频域解调，以量化荧光强度指数衰减引起的延迟。
图1
FLIM最常见的实现是使用一种称为TCSPC的快速电子方法如图1(a)。在TCSPC中，一个快速秒表测量一个激发光子和发射光子。这个时间定义了每个发射光子的到达时间。用时间-幅值转换电路(TAC)对快时钟时间进行实验测量，该电路将光子到达时间转换为可记录的模拟电压。在传统的TCSPC中，在高光子计数率下，由于仪器的死区时间，大多数入射光子将无法被测量。这将导致堆积效应，即每个激发脉冲只记录到达时间较短的光子。光子的损失与较长的到达时间将产生一个不正确的光子直方图，导致测量的荧光寿命的整体缩短。为了避免这些影响，探测器上的光子计数较低是可取的，理想情况下<10%的激励重复率。因此，通常情况下，时域方法通过多个激励脉冲检测一个荧光光子，因此需要多个激励脉冲来构建直方图如图1(a)及1(b)。通过光子计数测量的FLIM的信噪比，(SNR)取决于每个像素(N)检测到的光子数量，因此它随N的平方根而变化。
因此，为了改进FLIM的信噪比，光子探测过程重复数千次，生成荧光光子到达时间的分布，即测量到的指数荧光衰减，提高了通过曲线拟合的FLIM数据分析的准确性。
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