时间分辨荧光光谱是基础物理和生命科学领域中强大的分析工具，目前大部分是一些有物理背景的科研人员在做这方面的研究，期待不
久的将来能催生时间分辨荧光光谱在生命科学领域中的广泛应用。
在时域范围内实现时间分辨荧光光谱需要记录激光脉冲激发后发射光随时间变化的强度分布。理论上可以记录单个激发-发射循环的信
号的时间衰减曲线，但在实际应用中还存在着许多问题。首先，要记录的时间衰减非常快，比如普遍使用的有机荧光团的光致发光过程
仅持续几百皮秒到几十纳秒；另外不仅要获取荧光寿命，还要还原荧光衰减曲线形状，通常为了解决多指数衰减，必须能够在时间上将
记录的信号解析到这样的程度：由几十个样品进行衰减。
使用普通的电子瞬态记录仪很难达到所需的时间分辨率。 另外如果发射的光太弱则无法产生代表光通量的模拟电压。 实际上光信号可
能只有每个激发/发射周期的几个光子。 然后信号本身的离散特性导致无法进行模拟采样。 即使可以通过增加激发功率来获得更多荧
光，也会存在限制，例如，由于收集光学损耗、检测器灵敏度的光谱限制或在更高激发功率下的光漂白。最终，当观察到的样品仅由几
个甚至单个分子组成时，就会出现问题。
使用时间相关单光子计数（tcspc）可以有效解决上述问题。通过周期性激发可以将数据收集扩展到多个激发和发射循环，因此可以
从多个周期中收集到的单光子事件中重建单个周期的衰减曲线。
该方法基于对单个光子的重复、精确定时配准。 计时的参考是相应的激发脉冲。 单光子灵敏探测器可以使用光电倍增管 (PMT)、微通
道板 (MCP)或单光子雪崩二极管 (SPAD)。 假设每个周期记录一个以上光子的概率很低，每个时间段光子到达形成的直方图表示从单
次时间分辨模拟记录中获得的时间衰减。 如有必要，可以通过衰减样品处的光来满足单光子概率的前提条件。
如上图说明了如何在多个周期内形成直方图。激光脉冲反复激发产生光致发光。 激发和发射之间的时间差是由像秒表一样的电子设备
测量的。 如果满足单光子概率条件，实际上在许多周期中根本没有光子。应该注意的是光子或空循环的出现完全是随机的，只能用概
率来描述。 因此，这同样适用于各个秒表读数。
如上图所示，秒表读数被分成一个由一系列“时间段”组成的直方图。 时间段的宽度通常对应于秒表的分辨率（几皮秒），但可以选
择更宽以覆盖更长的总时间跨度。 时间分辨荧光实验的典型结果是一个直方图，随着时间的推移，计数呈指数下降。对多个分子的单
次激发实验中荧光强度呈指数下降可以解释如下：假设从 1000 个激发分子开始，设每个分子在第一个纳秒内返回基态的概率为
50%，在下一纳秒的观察中，又损失了 50%，依此类推，由于光的强度是由在任意时间段内发射的光子数量决定的，因此它与受激分
子的存在数量成正比。
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