活体组织中细胞和细胞器的长时间高时空分辨率监测对理解其生理现象具有重要意义，但是组织特殊的光学属性使得长时间高时空分辨率监测非常困难。细胞的离体观察难以反映其在体内的真实生物动态，例如肿瘤细胞在体外很容易被杀死，而在活体环境时，受到三维组织以及各种细胞因子的影响，想要杀死肿瘤细胞就变得没那么容易。这个时候，就需要有效的三维活体成像手段来替代二维的体外研究。细胞之间以及细胞内的活动往往需要高时空分辨率的手段来应对，特别是哺乳动物，心跳和呼吸会在没有高成像速率的情况下引入运动模糊和伪影。组织中折射率的不均匀分布会导致严重的光学像差，从而降低图像分辨率和信噪比(SNR)。强光剂量会干扰正常的细胞行为和细胞器功能，导致活体成像的光子剂量有限，即信噪比低，时间分辨率也会下降。
2021 cell:数字自适应光学迭代层析用于三维活体亚细胞毫秒级动态小时级观测
技术背景：
活体组织中细胞和细胞器的长时间高时空分辨率监测对理解其生理现象具有重要意义，但是组织特殊的光学属性使得长时间高时空分辨率监测非常困难。细胞的离体观察难以反映其在体内的真实生物动态，例如肿瘤细胞在体外很容易被杀死，而在活体环境时，受到三维组织以及各种细胞因子的影响，想要杀死肿瘤细胞就变得没那么容易。这个时候，就需要有效的三维活体成像手段来替代二维的体外研究。细胞之间以及细胞内的活动往往需要高时空分辨率的手段来应对，特别是哺乳动物，心跳和呼吸会在没有高成像速率的情况下引入运动模糊和伪影。组织中折射率的不均匀分布会导致严重的光学像差，从而降低图像分辨率和信噪比(SNR)。强光剂量会干扰正常的细胞行为和细胞器功能，导致活体成像的光子剂量有限，即信噪比低，时间分辨率也会下降。为了解决组织长时间高时空分辨率监测非常困难的问题，研究人员开发出了各种各种的技术手段。过去的十年中，亚细胞活体显微镜有了大幅的发展，例如转盘共聚焦显微镜、自适应光学 (AO)、高速双光子显微镜和光片显微镜 (LSM)，它们与新的动物模型一起促进了神经科学、发育生物学、免疫学和癌症生物学领域的各种研究。然而，在分辨率、速度、SNR 和样本健康之间存在难以躲避的矛盾，这在实时荧光成像中被称为“挫折金字塔(pyramid of frustration)”。在通常需要对多个平面进行轴向扫描的三维 (3D) 生物体中，情况变得更糟。一次实验的时间窗口只能支持数百个体积采集，以避免总光剂量超过 300 J/cm2 从而造成相当大的光损伤。 LSM 通过仅激发对焦区域以避免不必要的曝光来缓解该问题。带有 AO 的晶格 LSM进一步提高了透明生物体的时空分辨率，但小视野 (FOV) 和 AO 校正都限制了其大体积观测时的速度。此外，由于组织不透明和空间限制，很难以亚细胞分辨率在哺乳动物组织中应用 LSM。在哺乳动物中以亚细胞分辨率和低光子剂量进行长期、高速成像仍然是一个挑战。在各种体积成像手段中，光场显微镜能够实现高速三维成像。
当前不足：
三维组织成像、像差校正、光毒性是当前活体成像的三大难题。光场显微镜虽然具有高速三维成像能力，但是受到海森堡不确定性原理的限制，其空间分辨率与角度分辨率是一对矛盾量，无法同时获得高空间分辨率和角度分辨率。
文章创新点：
基于此，清华大学的Jiamin Wu(第一作者)和Qionghai Dai(通讯作者)等人受果蝇复眼和摄影中亚像素偏移手段的启发，提出了一种数字自适应扫描光场交互迭代层析显微镜(digital adaptive optical scanning light field mutual iterative tomography, DAOSLIMIT)技术。其具有高速、高分辨率 3D 成像、自适应光学像差校正和低光毒性的优势。可实现 225 X 225 X 16 um3 的体积成像，横向分辨率高达 220 nm，轴向分辨率高达 400 nm，时间分辨率达毫秒级，观测时长可达小时级。作者研究了不同物种的大规模细胞迁移和神经活动，并观察了哺乳动物在中性粒细胞迁移和肿瘤细胞循环过程中的各种亚细胞动力学。
（1） 开发了一种紧凑的扫描光场显微镜系统，该系统利用图像平面的周期性漂移收集高分辨率的四维空间-角度信息(二维在角度域，二维在空域)，实现衍射极限分辨率图像重建。
（2） 提出数字自适应光学像差校正方法，应对组织成像中存在光学像差的问题。利用扫描光场显微镜不同角度测量之间的差异估计像差，然后通过数字平移角度图像校正像差。相比传统的自适应光学，不需要波前传感器或空间光调制器。
原理解析：
（1）利用小尺寸微透镜的衍射效应，借鉴叠层成像的原理，通过二维振镜周期性的扫描像平面，以牺牲时间分辨率为代价，同时获得高的空间分辨率和角度分辨率。如图1A和C所示。
（2）如图1B和C，不同分割孔径上的线性相位调制对应角度分量的空间平移，使得不仅可以从角度测量之间的不一致估计空间非均匀像差，也可以通过数字平移角度图像来校正像差。这一过程称为数字自适应光学(DAO)。交互迭代层析算法基于ADMM，集成了迭代波前估计和拼接像差(tiLED aberration)校正后体积重建，可以提高复杂场景成像的分辨率和信噪比。（3）利用具有时间加权和时间循环的时空平滑先验算法，缓解由运动伪影和扫描引起的成像速度下降问题。DAOSLIMIT提供了时空域的一个周期性的稀疏采样模式。如图1E，对于每一个角度分量，在一个扫描周期内的局部时空域做反距离加权(这在地理学中经常使用)。通过一个滑行窗口的交错重建(interleaved reconstruction)，可以得到高分辨率的延时角度分量，帧率高至相机帧，且没有运动伪影，这种算法称为时间加权算法，如图1F所示。时间循环算法被开发用于视频重建，以加速收敛。通过对以不同的速度移动的样品成像，验证了算法的有效性，速度可高至55像素/帧，甚至非均匀运动也适用。
视频1：原理示意及实拍效果
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