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LCOS液晶空间光调制器在结构光超分辨的应用

发布时间:2020-04-22 15:40:32 浏览量:39


和其它光电产品一样,不同的应用决定了我们要灵活选择合适参数的器件,正所谓俗话说得好,只选对的不选贵的。那么在医用生物

分辨显微中,为何结构光超分辨显微如此受欢迎?而在结构光超分辨显微中为何大佬们都热衷使用ForthDD液晶空间光调制器呢?下

面让我们来探讨一下。


什么是结构光超分辨显微?众所周知如果使用传统光学显微成像,那么一定绕不开的问题是分辨率大小,而分辨率大小又受到阿贝衍射

极限的限制。网上已经有很多关于衍射极限的详细知识了,比如下图。我在这里就通俗讲一下:就是当所观察的目标直径小于200nm

时,传统光学显微镜就无法将它和其他不想看的物质分辨开了。也许在以前观察的物质都是直径大于200nm,我们还不会受到衍射极

限的困扰,可是在科技日新月异的现在,我们要观察的物质越来越小。尤其是在利用荧光成像的活体细胞领域,比方说以前我们要观察

直径大小有500nm左右的线粒体,还不会被200nm的衍射极限所影响,我们能分辨出线粒体发出的荧光成像。可是当观察线粒体中只

有30nm大小的的核糖体时,想要观察它就必须突破衍射极限,否则就被线粒体的荧光掩盖了。但这又怎么能难到足智多谋的科学家

呢,为了从某种意义上“突破衍射极限”,科学家发明了3种超分辨显微。

第一种STED超分辨显微成像:分辨大小可达20nm~60nm的受激发射损耗,我们还是利用线粒体和核糖体来说明,只不过这个线粒体

的直径改成200nm。而科学家的办法就是利用“遮挡”用一种只能给线粒体染上的荧光蛋白给200nm的线粒体染上,然后用另一种特

殊的只能染核糖体的荧光蛋白给核糖体染上。用红光波长的光激发线粒体发荧光,然后用蓝光波长的光照射,这可就用到神奇的三原色

了(PS:就是小学常玩的用蓝色的水笔涂红色的纸,最后纸成了黑色),蓝光波长的光照会使原本激发线粒体发荧光的红光失效,却能

让核糖体上的蛋白发光。利用这样的“遮挡”使得30nm的核糖体能被观察到(PS:其实我感觉还是挺绕的)。虽然可以观察到最小达

20nm的目标,但是它的问题是超高的光损耗(毕竟用到两种光却只有一种光生效)和极其受限制的荧光蛋白(这种东西肯定不会便

宜)导致在活细胞成像领域其实是不好用的。


第二种单分子定位超分辨显微成像(SMLM):分辨率可达10nm~30nm的随机单分子定位。为了便于解释,我们还是利用线粒体和

核糖体来说明,只不过核糖体又成了可怜的10nm大小了。也是利用只染核糖体的特殊荧光蛋白给核糖体染上,然后用光(一般是

405nm波长)在极短的时间里照射,记录下核糖体发光的部位。接着呢用另一种光(一般用488nm波长)照射使荧光蛋白暂时失活,

然后再用405nm的光激活,如此往复千万次,将荧光蛋白发光轨迹记录下来并拟合计算,就得到核糖体全貌,至于什么PALM,

FPALM以及STORM都和以上大同小异。存在的问题也很明显,那就是耗费时间太长了,万一核糖体活不了那么久怎么办?

 

第三种结构光超分辨显微成像(SIM):自然是要用到我们的ForthDD LCOS铁电液晶空间光调制器的结构光超分辨显微成像啦,为了

说明原理我们再次请到了我们的劳模同志核糖体,不过这次核糖体又长成了50nm了。如果说上述方法是利用核糖体局部来表征整体,

那么结构光就是用简单来表征复杂。这就用到了莫尔条纹:当两个高频且相近的光发生干涉时,它们的干涉光条纹变为低频。我们利用

4thDD铁电液晶空间光调制器将调制好的两束结构光照射到我们要观察的核糖体区域,然后不断从各个方向照射,将得到的荧光干涉

图案用scmos相机捕捉后经过傅里叶变化,卷积处理等重构后便能得到相当精确的核糖体图案了。而它相较以上超分辨的优势则是激

发光强度弱,对荧光染料没有什么要求,成像速度快,是用于活体细胞成像的不二之选。

 


ForthDD LCOS铁电空间光调制器在结构光照明显微中的应用

苏州医工所使用的照明显微激光—结构光超分辨系统(线性/非线性结构光光路共用)光路原理如下图所示,采用4路激光(405、

488、561、647nm)(PS:如果您觉得这种光路过于复杂的话可以使用昊量光电独家代理的法国Oxxius可定制合束激光器,一台激

光器最多搞定8种光源,对付4光路简直不要太简单!)对铁电液晶空间光调制器LCOS(型号:SXGA-3DM)进行照明,激光经过光

纤耦合-准直扩束系统后经偏振分光棱镜(PBS)后垂直投射到LCOS上获得相位调制;衍射光经过傅里叶透镜后在其后焦面上得到频

谱;采用MASK滤波系统进行空间滤波,仅使-1级和1级衍射光通过;两束光波干涉产生余弦分布的高对比度结构光条纹激发荧光样

品。进行三维成像时,切换MASK滤波器让0级光和±1级光同时通过并干涉产生结构光条纹。系统所用物镜为奥林巴斯NA1.49、

100×浸油TIFR物镜。线性结构光模式时,采集三个方向角上三个相位的荧光图像(共9张)进行图像重构;非线性结构光模式则采集

6个方向角上5个相位共30帧荧光图像。


 


当然,为了保证结构光能发生高对比度的稳定干涉,必须调整结构光偏振态。如果需要实时调整,这里我们建议采用1/4波片和1/2

波片配合LCC实现。


北京大学在应用偏振光结构光超分辨显微技术(PSIM)研究蛋白在亚细胞结构中的定位和取向时应用Forthdd 公司SXGA—3DM空间

光调制器成功提取荧光分子的偶极子方位信息与超分辨结构信息。同时,研究人员进行了大量的生物学实验来证明其广泛的适用性,如

λ-DNA、BAPE细胞和小鼠肾组织中的肌动蛋白丝、肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互作用,以及中GFP染色的U2OS活细胞微管。特别

是,研究小组针对神经元中的膜相关周期骨架(MPS)进行了研究。PSIM以极其高的空间分辨率和准确的偏振检测,揭示了肌动蛋白

环在MPS中“并排”组装的新模型,推翻了以往发表在Science上的肌动蛋白环“端到端”的结构假设。

 

图中pSIM揭示了肌动蛋白环在MPS中“并排”组装的新模型,推翻了以往的肌动蛋白环“端到端”的结构假设


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