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荧光显微观察方式

发布时间:2020-07-08 16:07:39 浏览量:35


现在大家所常见的普通光学显微镜是在16世纪末期在荷兰发明的,当时的显微镜非常的简陋,只是由两片凸透镜组合而成的,在几十

年之后意大利科学家伽利略才真正意义上第一次在科学上使用显微镜,随着光学显微镜的发展,显微镜的组成结构越来越复杂,显微镜

的功能越来越强大,显微镜的分辨率也越来越高,随之显微镜也有了多种观察方式。


在现在成熟的商业显微镜上,分别有七种显微观察方式来对应不同类型的显微镜,并且同一台显微镜也可以配备多种显微观察方式,显

微镜的七种观察方式分别是,明视野观察(Bright Field BF)也叫明场,暗视野观察(Dark Field)也叫暗场,相差检测法(Phase 

contrast PH),偏光显微镜(Polarizing,micoscope),浮雕相称显微镜(RC HMC)也叫霍夫曼(Hoffman)显微镜,微分干涉

检测(Differential interference contrast DIC),以及今天我们要说的荧光观察(Fluorescence Microscope)

要介绍荧光显微镜,我们需要先简单介绍一下荧光原理:

在光的照射下,具有荧光特性的物质的电子在吸收能量后,可由低能级电子层跃迁到高能级电子层。高能态的电子是不稳定的,它会在

极短的时间内(10-8s),以辐射光的形式释放能量后,回到原来的能态。这时发出的光即为荧光(fluorescence),其波长比激发光

的波长要长,原理如图2-6所示。利用物质对光吸收的高度选择性,可制成各种滤片,吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通

过,用来激发不同的荧光素,产生不同颜色的荧光。

对于荧光的激发波长一般都在紫外和可见波段,而对于荧光的发射波段一般都在可见光波段 


观察荧光一般都采用落射荧光观察方式,就是激发光是由显微物镜照射到样品上,而不是大家常见的在样品下方进行透射照明的方式,

当然也存在一些使用透射荧光的观察方式,但是一般来说荧光的发射光是在样品360度方向都有发射光,而且发射光的强度只有激发光

强度的千分之一到百万分之一的量级,如果跟激发光同方向检测的话,会很大程度上干扰检测,成像的信噪比很差,甚至噪声干扰信号

会强于有效信号。

 图中就是落射荧光显微镜的示意图


在荧光激发方面,我们可以使用汞灯,LED灯等这类常见的照明光源来进行荧光激发,但此类照明方式有着明显的缺点,在使用第一滤

光片滤出单色光之后,其光强度非常的低,使得荧光信号强度也大幅降低,并且此类光源强度随着使用时间会有非常明显的功率下降,

此类光源一般使用寿命也都不长,现如今随着激光技术发展成熟,现在的荧光显微成像大都会使用激光作为激发光源,使用Oxxius

波长合束激光器来进行荧光激发,使用多波长合束激光器来进行荧光荧光激发会有非常好的激发光强度,激发光功率连续可调,不需要

加减光片来调节光强度,并且可以对激光进行高达兆赫兹级别的高速调制,这一点在某些超分辨显微成像方式里有着显著的优势,而且

因为oxxius合束激光器是线偏振激光,还可以进行某些荧光材料的偏振荧光分析。


在落射荧光显微镜中,除了光源,还有一个比较重要的组成部分就是荧光滤色块,它是由一片激发滤色片(一般是带通滤色片),一片

二向色镜和一片发射滤色片(一般是长通滤色片)组成的,如图所示:



在使用不同的荧光染料时,需要配和不同的荧光滤色块去使用,但如果使用激光就可以去除激发滤色片,只需要二向色镜和发射滤色片。