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光学介质与入射光波相互作用时其分子以自发散射方式随机发生的一种拉曼散射。 ...
SRS相对于自发拉曼与CARS的优点SRS是另一种相干拉曼散射(CRS)过程,其激发条件与共振CARS相同。与自发拉曼散射不同,在自发拉曼散射中,样品被一个激发场照亮,SRS中两个激发场在泵浦频率ωp和斯托克斯频率ωs处重合在样品上。如果激发束的差频Δω = ωp−ωs与焦点内分子的振动频率Ω相匹配,即分子跃迁由于分子跃迁的刺激激发,速率提高。分子居群从基态通过虚态转移到分子的振动激发态(图1A)。这与自发拉曼散射相反,自发拉曼散射从虚态到振动激发态的转变是自发的,导致信号弱得多。图1.受激拉曼散射原理(A) SRS的能量图。泵浦和斯托克斯束的共同作用通过虚态有效地将样品中的分子从基态转移到第 ...
理研究中,与自发拉曼相比,常用三种模式来提高信号强度:非线性拉曼散射技术,如受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS),以及表面增强拉曼散射(SERS)。图1在拉曼散射的非线性模式中,使用多个激光刺激特定的振动跃迁,从而增加信号的强度。简单地说,在SRS中,样品用自发拉曼中的“泵浦”激光照射,并结合较低频率的“斯托克斯”激光。斯托克斯激光器频率的选择使两种激光器之间的能量差(∆v)与特定振动跃迁的能量差相似,从而增强了该跃迁的发生,并增加了其信号(图1)。对于每个泵浦和斯托克斯频率组合,可以获得单个振动峰值的窄带测量。通过锁定其中一个激光器的频率并改变另一个激光器的频率,可以获 ...
信息。虽然比自发拉曼显微镜快几个数量级,但非线性拉曼成像的窄带宽版本提供的光谱信息远不如线性版本。要转变为真正的化学成像工具,需要在不显著影响CRS的速度优势的情况下扩大光谱含量。在这一需求的驱动下,2010年代的许多研究都致力于开发快速的高光谱CRS成像方法。CRS的另一个局限性是敏感性。尽管独立的单层脂质双分子层成像在早期为生物应用带来了希望,但产生这种信号所需的分子数量仍然超过105。然而荧光显微镜技术可以捕捉到来自单个分子的信号,即使是最敏感的CRS方法也需要成千上万个目标分子来产生可检测的信号。因此,关注提高灵敏度是扩大CRS技术使用的重要策略。CRS成像的对比度来源于分子化合物的振 ...
单频CARS与SRS显微系统单频CARS/SRS显微镜最具挑战性的部分是激发源,它必须产生两个同步的激光脉冲---泵浦和斯托克斯,需具有以下几点特征:1. 频率失谐在500和之间连续变化,以覆盖所有相关的振动跃迁。这意味着至少有一个泵浦/斯托克斯脉冲是广泛可调的。例如,假设一个固定的泵浦波长为800纳米,斯托克斯必须在835和1110 nm。2.脉冲持续时间为1 - 2 ps,对应于变换限制脉冲的带宽为以这种方式匹配压缩相中振动跃迁的典型线宽。这种选择优化了峰值功率和光谱分辨率之间的权衡。最佳脉冲持续时间也可以取决于实验条件,因为已经表明,在某些情况下,响应是一个与时间相关的函数,因此信号可以 ...
信号的真伪与自发拉曼散射相比,CRS技术可以产生更强的振动敏感信号。CRS技术在光学显微镜中的普及与这些大大提高的信号水平密切相关,这使CRS显微镜的快速扫描能力成为可能。然而,除了更强的振动信号之外,相干拉曼相互作用还提供了丰富的探测机制,用于检查各种各样的分子特性。一般来说,CRS技术比自发拉曼技术对介质的拉曼响应提供了更详细的控制。所以在实际搭建相干拉曼系统时,会有诸多问题。当首次构建CARS或SRS显微镜时,很难确定PMT或锁相放大器探测器上观察到的信号的来源。然而,可以使用一个简短的检查表来验证信号的身份。通常情况下,应使用强谐振样品(例如,两个盖卡片之间的一层薄十二烷),并对样品施 ...
标签。然而,自发拉曼效应是一个弱散射过程。对于成像和显微镜的应用来说,获得一个视场可能需要几个小时的信号整合时间。因此,相干拉曼散射方法,如刺激拉曼散射效应,现在被广泛用于拉曼成像。在这个应用说明中,我们将描述Moku:Lab的锁相放大器是如何在波士顿大学的先进的刺激拉曼成像装置中实现的。介绍拉曼光谱是一种非破坏性的分析化学技术。它直接探测样品的振动模式。与电子光谱法相比,拉曼光谱法提供了高化学特异性,而不需要荧光标签。样品可以以完全无接触和无标签的方式被询问,防止对系统的破话。红外(IR)光谱是另一种常用的获得振动光谱的方法。红外光谱和拉曼光谱的选择规则是不同的;红外光谱对偶极子的变化很敏感 ...
显微镜继承了自发拉曼光谱的优点, 是一种能够快速开发、label-free的成像技术,同时具有高灵敏度和化学特异性[3-6], 在许多生物医学研究的分支显示出应用潜力,包括细胞生物学、脂质代谢、微生物学、肿瘤检测、蛋白质错误折叠和制药[7-11]。特别的是,SRS在对新鲜手术组织和术中诊断的快速组织病理学方面表现出色,与传统的H&E染色几乎完全一致[12,13]。此外,SRS能够根据每个物种的光谱信息,对多种组分的混合物进行定量化学分析[6,7,14]。尽管在之前的研究[17]中已经研究了痛风中MSU的自发拉曼光谱,但微弱的信号强度阻碍了其用于快速组织学的应用。因此,复旦大学附属华山医 ...
的进步。对于自发拉曼光谱,电荷耦合器件(CCD)探测器允许在合理的速度下电子读出高质量光谱,大功率窄线宽近红外(NIR)激光器为生物样品提供了几乎理想的激发源,和高保真光学滤波器现在具有良好的抑制激发光的锐利边缘接近激发频率将这些先进的光电器件与光学或完全不同的仪器(如扫描探针显微镜)相耦合,可以用微或纳米尺度的空间分辨率探测材料的分子结构。所有这些进步已经将拉曼光谱从一种昂贵的专业技术转变为遍及物理和生命科学领域的普通台式仪器。当然,技术的进步还在继续,新的和看起来遥远的光学领域在拉曼光谱仪器中得到了应用。空间光调制器(SLM)设备越来越多地用于自发和非线性拉曼光谱测量。大多数SLM设备技术 ...
。例如,使用自发拉曼微光谱对生物标本进行化学分析或成像需要几十秒或几分钟的时间。表面增强拉曼散射(SERS)、相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)被开发用来增强拉曼散射信号,以提高拉曼分析或成像的速度。然而,在SERS中使用金属纳米颗粒对生物应用造成了一些缺点,CARS或SRS通常局限于查询一个振动模式,而不是同时测量标本的全拉曼光谱。在不使用外源标记或纳米颗粒的情况下获得完整的光谱(例如400-2000 cm-1)可以更好地了解样品中的化学成分和分子结构。为了提高自发拉曼光谱的分析通量或成像速度,人们也做出了努力。线扫描拉曼成像系统使用激光线照明代替单一激光焦点,与传统 ...
短激发波长的自发拉曼散射显微镜尽管有高分辨率,但是其灵敏度不够,成像速度不足。相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)显微镜的灵敏度要高于自发拉曼散射显微镜,但是因为非共振背景的存在,限制了其探测灵敏度。受激拉曼散射(stimulated raman scattering,SRS)于1968年初次观测到,随后在许多光谱研究中得到广泛的应用。在自发拉曼散射中,由于非弹性散射的机理,一束频率为wp的激光束照射样品,生成频率分别为wS和wAS的斯托克斯和反斯托克斯信号。在SRS中,使用两束激光wp和wS同时照射样品。频率差Δw= ...
敏度。荧光和自发拉曼信号在波长维度上重叠,因此不能用简单的滤光片分离。幸运的是,它们在以下性质上有所不同,这是许多拉曼测量中荧光抑制方法的基础:1.荧光发射寿命(纳秒量级)远长于拉曼散射寿命(皮秒量级)。这一原理产生了各种时域方法,其中一个超快脉冲激光器用于激励,可应用于时域拉曼光谱系统,需要注意的是,激光脉冲不应该太短,因为小于1ps的脉冲不太单色,这会导致光谱分辨率的严重损失。超快光脉冲序列激发样品晚到荧光发射后的快到拉曼散射光可以被短时分离。2.当激发光在高频率下进行调制时,荧光和拉曼信号寿命的差异可以转化为比拉曼信号更大的相位延迟和幅值解调荧光。这一原理是所有频域方法的基础。3.拉曼光 ...
标记。然而,自发拉曼现象是一个非常弱的散射现象。如果直接使用自发拉曼进行成像或者显微研究,一张图可能需要几小时的采集时间。因此,相干拉曼方法,如受激拉曼散射如今被广泛的应用于显微镜研究。在这个应用指南中,我们将讲述如何使用Moku:Lab的锁相放大器进行受激拉曼散射的信号探测。背景介绍拉曼光谱是一种非破坏性的分析化学方法。它可以用来直接探测分子的振动模式。相比于基于电子能级的光谱光谱方法,拉曼光谱显著提高了测量的特异性,而且不需要在系统中引入荧光标记。被测样品能够以完全无接触,无标记的方法进行检测,防止了其他因素对系统的影响6,7。红外光谱是另一种常见的分子振动光谱方法。红外与拉曼光谱有着不同 ...
谱分辨率。与自发拉曼光谱不同,自发拉曼光谱可以用单色激光同时测量所有拉曼光谱,而受激拉曼光谱则需要进行波长调整以测量其他光谱点,并且在获取光谱图像时调整激光波长会限制测量速率。另一方面,飞秒激光器本身具有广谱。可以使用一种称为“光谱聚焦”的技术来快速调整泵和斯托克斯束之间的能量差。可以在更短的时间内获取光谱图像。但是,这种方法增加了系统的光学复杂性。需要在光束路径中添加一对衍射光栅或高折射率材料(例如SF57玻璃棒),让光谱范围受到限制。有关频谱聚焦方法的详细说明可以在最近的出版物中找到。简而言之,如果一次关注单个拉曼位移,则皮秒激光的设置要简单得多。飞秒激光器是快速高光谱图像采集的首选,但系 ...
高灵敏度:与自发拉曼显微镜相比,CARS 产生更密集和定向的信号;反斯托克斯CARS信号的频率超过泵浦波频率,并且在没有斯托克斯发光杂散光的光谱范围内被检测到;CARS 信号仅在激发强度的焦点处出现。它允许使用非共焦针孔以高空间分辨率进行成像,并且还可以执行 3D 逐层扫描,同时将相邻层对测量结果的影响降至很低;CARS 信号的光谱分辨率仅由泵浦激光线的宽度定义,这简化了光谱测量,因为无需任何光谱仪器即可检测 CARS 信号;CARS 信号与分子浓度的平方成正比,它允许使用 CARS(以及该方法的选择性和非侵入性)定量测量样品中的化学物质浓度;用于生物样品的微创(非破坏性)CARS 方法。由于 ...
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