拉曼光谱的主要优点之一是其自发性质，可以对生物样品进行无标签光谱分析。然而，自发拉曼只发生在大约1 / 108的入射光子中，这严重限制了信号的强度。许多生物样品在可见范围内发出荧光，这可能会压倒拉曼信号，这进一步加剧了这一事实。
拉曼光谱成像模式的优化方法
为了减少来自荧光对拉曼信号的影响，人们可以使用长波长激光，但是相应的拉曼信号会有所降低。目前，大多数拉曼成像是在700到900纳米之间进行的，在这个范围内，可以发现自发荧光和拉曼信号之间的妥协。即便如此，需要很长的采集时间来检测足够的光子，并获得可接受的信号噪声。在快速系统中，获取足够的光子来测量单个拉曼光谱大约需要0.5秒，这意味着通过点扫描获得一幅512 × 512像素的拉曼图像需要36小时。为了克服这一限制，人们已经开发了几种拉曼成像模式和技术，可分为两种主要策略:提高成像采集速度和提高信号强度。
在第一种策略中，对图像采集设置进行了修改，以提高成像采集速度，以便即使有低拉曼信号，也可以在更短的时间内获取图像。这通常是通过离开点扫描方法，并试图同时获得几个像素来实现的。目前已开发的主要方法是线扫描和缝扫描、宽视场轻片显微镜成像和多焦成像。这些方法通常达到比点扫描成像快20倍的采集速度，即使它们对活细胞成像不够快，但它们构成了拉曼光谱许多其他应用的合适替代品。
在第二种策略中，通过使用不同的拉曼模式来增加拉曼信号的强度，这反过来允许更短的捕获时间。在脑生理病理研究中，与自发拉曼相比，常用三种模式来提高信号强度:非线性拉曼散射技术，如受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)，以及表面增强拉曼散射(SERS)。
图1
在拉曼散射的非线性模式中，使用多个激光刺激特定的振动跃迁，从而增加信号的强度。简单地说，在SRS中，样品用自发拉曼中的“泵浦”激光照射，并结合较低频率的“斯托克斯”激光。斯托克斯激光器频率的选择使两种激光器之间的能量差(∆v)与特定振动跃迁的能量差相似，从而增强了该跃迁的发生，并增加了其信号(图1)。对于每个泵浦和斯托克斯频率组合，可以获得单个振动峰值的窄带测量。通过锁定其中一个激光器的频率并改变另一个激光器的频率，可以获得宽带或高光谱测量，因此可以扫描和检测振动跃迁的整个范围。信号强度的增加使得512 × 512像素图像的视频速率成像达到25fps。此外，在SRS中，信号随采样分子的浓度线性缩放，允许定量成像。
CARS也是一种非线性多光子技术，样品由泵浦和斯托克斯短脉冲激光器照射。在SRS中，这些激光经过调谐，使它们能量差与目标分子特定振动跃迁的能量重合，在高于基态的能级上诱导特定相干振动。这些振动分子被第三个“探测”激光探测，通常与泵浦激光频率相同，使它们回到基态并产生频率高于探测激光的反斯托克斯信号(图1)。通过固定泵浦激光的波长和改变斯托克斯光束的频率，可以获得像SRS中那样的宽带测量。CARS实现了信号强度的1000倍提高，并且由于散射光是蓝移的，因此它不受自荧光的干扰。与SRS一样，信号强度的增加允许更短的采集时间，允许高达20 fps的视频速率成像。与SRS不同，CARS信号与浓度呈非线性相关，因此定量成像并不简单。
第三种信号增强技术，SERS，依赖于修改样本来增强信号。在SERS中，使用金和银等金属纳米颗粒，当受到入射光的撞击时，它们的表面会产生强烈的电磁场，增强目标分子的拉曼信号。这一过程背后的物理现象尚不完全清楚，但已经确定的是，使用SERS信号可以提高到1014-1015倍，甚至可以检测单个分子。因为金属表面提供了增强，感兴趣的分子必须与被检测的金属相互作用。尽管这限制了该技术的应用，但它可以通过使用靶向特定细胞器或分子的纳米颗粒实现选择性可视化。
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