因为各种化学键有其特征频率，使得基于红外吸收和拉曼散射的振动显微术可被用作为无标记对比度机制。然而使用长波长的红外显微镜的分辨率不够，使用短激发波长的自发拉曼散射显微镜尽管有高分辨率，但是其灵敏度不够，成像速度不足。相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)显微镜的灵敏度要高于自发拉曼散射显微镜，但是因为非共振背景的存在，限制了其探测灵敏度。
基于受激拉曼散射显微镜的高灵敏度无标记生物医学成像
技术背景：
因为各种化学键有其特征频率，使得基于红外吸收和拉曼散射的振动显微术可被用作为无标记对比度机制。然而使用长波长的红外显微镜的分辨率不够，使用短激发波长的自发拉曼散射显微镜尽管有高分辨率，但是其灵敏度不够，成像速度不足。相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)显微镜的灵敏度要高于自发拉曼散射显微镜，但是因为非共振背景的存在，限制了其探测灵敏度。
受激拉曼散射(stimulated raman scattering,SRS)于1968年初次观测到，随后在许多光谱研究中得到广泛的应用。在自发拉曼散射中，由于非弹性散射的机理，一束频率为 wp 的激光束照射样品，生成频率分别为wS 和 wAS的斯托克斯和反斯托克斯信号。在SRS中，使用两束激光wp 和 wS同时照射样品。频率差 Δw = wp − wS(也称为拉曼频移(Raman shift))与特定的分子振动频率Ω匹配时，拉曼信号凭借受激激发被放大。因此，斯托克斯光束的强度获得增益放大ΔIS(称为受激拉曼增益(stimulated Raman gain, SRG))，泵浦光束强度减小ΔIp(称为受激拉曼损耗(stimulated Raman loss, SRL))。当Δw不匹配任何振动频率时，不存在SRL和SRG，因此，不同于CARS，SRS没有非共振背景噪声。
当前不足：
用于生物成像无标记成像时，自发拉曼散射灵敏度低，相干反斯托克斯拉曼散射有背景噪声。当前的SRS已经被用于作为一种对比度机制，但是生成的SRS信号有过高的峰值功率，用于生物样品成像会造成光损伤，且其重复频率低使得成像速度也不高。
文章创新点：
基于此，美国哈佛大学的Christian W. Freudiger(第一作者)和X. Sunney Xie(通讯作者)等人提出一种基于受激拉曼散射的三维多光子振动成像技术，可以利用生物的内源性对比度介质，进行无标记生物医学成像。
原理解析：
（1）高重复频率皮秒激光生成泵浦光和斯托克斯光。使用76MHz重复频率，7ps脉宽锁模Nd:YVO4振荡器同时生成1064nm斯托克斯光束和532nm光束。532nm光束经过可调谐光学参量振荡器(optical parametric oscillator,OPO)生成所需泵浦光束(见图1D和图2)。
（2）高频相位敏感(phase sensitive)检测机制提取信号。由于在(1)的激发条件下所获得的SRL和SRG信号被掩埋在激光噪声里(ΔIp/Ip 和 ΔIS/IS < 10−4)，激光噪声主要在低频部分。对于SRL，以1.7MHz的频率调制斯托克斯光束的强度，并使用锁相放大器以相同的频率检测由此产生的泵浦光束的强度调制(见图1C)。类似地，SRG可以通过调制泵浦光束，检测斯托克斯光束来测量。使用此方法可以检测ΔIp/Ip 和 ΔIS/IS的强度变化，灵敏度比之前报道的要高四个数量级。
（3）SRL在Ip和IS中都是线性的。SRL对分析物浓度的线性依赖(见图1E)使得直接进行定量分析是可行。图 1F 中显示了反式视黄醇(trans-retinol)的孤立拉曼峰的SRL、自发拉曼和 CARS 光谱。尽管 SRL 和自发拉曼光谱几乎相同，但 CARS 光谱表现出与拉曼频移无关的非共振背景，以及由于背景干扰导致的光谱失真。对于具有多个峰的光谱，也可以看到 SRL、SRG 和自发拉曼光谱之间的良好一致性（图 1G）。
视频1：使用 SRL 显微镜获取的小鼠脑部三维图像堆栈。CH2提供对比度突出了神经元周围的髓鞘。SRL 显微镜的三维切片能力是显而易见的。
视频2：使用 SRL 显微镜获取的小鼠脑部三维图像堆栈。CH2提供对比度突出了富含脂质的结构：角质层的细胞间隙、活性表皮中的毛囊和真皮中的皮脂腺（所提结构按视频时间顺序出现）。
视频3：使用同时双色 SRL 显微镜所获得的小鼠皮肤三维图像堆栈。将二甲基亚砜(DMSO) 应用于皮肤，通过调谐到 670cm-1 峰（绿色通道）获得对比度。从 2845 cm-1 峰（红色通道）获得内源性脂质对比度。视频覆盖距离表面约 80 μm 的深度，并显示 DMSO 通过亲水途径渗透。
参考文献：Freudiger CW, Min W, Saar BG, Lu SJ, Holtom GR et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science 2008; 322: 1857–1861.
DOI：https://doi.org/10.1126/science.1165758
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