拉曼效应是由C.V.拉曼在20世纪20年代首次发现。它是一种广泛使用的光谱方法来确定分子的振动模式。与其他分析化学方法相比，光谱方法提供了高空间分辨率。不需要直接接触就可以获得化学信息。振动光谱提供了合理的化学特异性，而不需要额外的标签。然而，自发拉曼效应是一个弱散射过程。对于成像和显微镜的应用来说，获得一个视场可能需要几个小时的信号整合时间。因此，相干拉曼散射方法，如刺激拉曼散射效应，现在被广泛用于拉曼成像。在这个应用说明中，我们将描述Moku:Lab的锁相放大器是如何在波士顿大学的先进的刺激拉曼成像装置中实现的。
拉曼效应是由C.V.拉曼在20世纪20年代首次发现。它是一种广泛使用的光谱方法来确定分子的振动模式。与其他分析化学方法相比，光谱方法提供了高空间分辨率。不需要直接接触就可以获得化学信息。振动光谱提供了合理的化学特异性，而不需要额外的标签。然而，自发拉曼效应是一个弱散射过程。对于成像和显微镜的应用来说，获得一个视场可能需要几个小时的信号整合时间。因此，相干拉曼散射方法，如刺激拉曼散射效应，现在被广泛用于拉曼成像。在这个应用说明中，我们将描述Moku:Lab的锁相放大器是如何在波士顿大学的先进的刺激拉曼成像装置中实现的。
介绍
拉曼光谱是一种非破坏性的分析化学技术。它直接探测样品的振动模式。与电子光谱法相比，拉曼光谱法提供了高化学特异性，而不需要荧光标签。样品可以以完全无接触和无标签的方式被询问，防止对系统的破话。红外（IR）光谱是另一种常用的获得振动光谱的方法。红外光谱和拉曼光谱的选择规则是不同的；红外光谱对偶极子的变化很敏感，而拉曼光谱对偏振性的变化很敏感。这使得红外和拉曼成为一组特定化学键的良好工具。对于成像和显微镜的应用，在选择红外或拉曼光谱时，还有两个重要因素需要考虑。1）空间分辨率要求。红外光谱法使用红外光作为光源。拉曼可以使用可见光或近红外（NIR）激光器进行激发。由于可见或近红外激光器的波长更短，拉曼显微镜的空间分辨率可以达到亚微米级。另一方面，红外光的波长为几微米。对于许多显微镜的应用来说，其空间分辨率被认为是很差的。2）水在红外区域有强烈的吸收。对于富含水的环境（如生物样品），红外光会受到强烈的背景吸收。因此，在某些情况下，拉曼是首选。
与占主导地位的瑞利散射相比，拉曼散射非常弱。为了获得合理的信噪比，通常需要几秒钟的长积分时间。这对于常规光谱学来说可能不是问题，但对于光谱成像来说，可能需要几个小时才能得到一个视野。为了增强信号，多年来已经开发了几种不同的方法。基于质子的方法，如表面增强拉曼光谱，进一步降低检测极限到单分子水平。相反，纳米颗粒的诱导不均匀性使其难以成像。对于成像科学家来说，更有前途的方法是非线性光学增强的相干拉曼散射方法：刺激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。
相干拉曼效应最早发现于20世纪60年代6。在20世纪90年代末和21世纪，由于超快锁模激光器的进步，Sunney Xie和他的同事们率先将CARS9和SRS10用于无标签化学显微镜。从那时起，这些技术已被广泛用于化学、生物学和材料科学研究。 CARS和SRS有很多相似之处；这些非线性光学过程通常发生在相同的条件下，仪器设置也几乎相同。然而，也有一些不同之处；就像自发拉曼一样，CARS信号（图1，ωas反斯托克斯）与进入的激光束（ωp，泵浦，ωs斯托克斯）相比，发生在不同的波长。用短通滤波器很容易将信号与入射光分开。到达检测器的光子总量很小，更敏感的光子检测器，如光电倍增管（PMTs）被用来检测。然而，CARS受到由其他非共振非线性光学效应产生的背景的影响。这些效应不仅限制了CARS测量的实际检测极限，而且还扭曲了光谱（与分子振动共振相比）。另一方面，SRS信号不受大多数其他非线性光学效应的干扰。然而，SRS是一个受刺激的发射过程。信号发生在与入射光线相同的波长上。SRS效应只是稍微增加/减少了斯托克斯和泵浦光束的光子数量，分别。这些变化是如此之小，以至于无法用常规的时域测量方法来测量。因此，SRS需要有锁定检测的光学泵探技术。
泵-探针法是一种广泛采用的检测多光子过程的方法。该实验通常涉及两个超快（皮秒或飞秒）激光束。一束激光始终照亮样品，而第二束激光则以恒定的频率进行调幅调制。因此，由第二束激光引起的任何变化或扰动都会以调制频率转移到第一束激光上。在检测器上，一个光学滤波器被用来阻挡调制光束。只有未调制的波长被检测到。由于信号只发生在调制频率附近，通常使用锁相放大器（LIA）来放大信号。 锁定放大器使用同调检测方法，它将输入的信号与调制频率的正弦局部振荡器混合。然后它将信号通过一个低通滤波器和电压放大器（可选），输出到数字转换器或示波器。这确保只有非常接近调制频率的信号被放大和检测。其他频率的信号（如激光重复频率或直流背景）被拒绝。这使得锁相放大器成为泵浦探针检测的重要工具。关于锁相放大器更详细的解释可以在以下视频中找到：https://youtu.be/H2O2ADqEkHM 和 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg。
特别是对于SRS来说，两束光（泵和斯托克斯）被调谐成与感兴趣的拉曼位移精确匹配的能量差。在理论上，泵浦或斯托克斯光束都可以被调制，而另一光束则用于检测。如果泵浦光束被调制，在泵浦光束开启的情况下，SRS过程会引起斯托克斯光束的轻微增加。在检测器上，泵浦光束被阻断，只有斯托克斯光束被检测到。这就是所谓的刺激拉曼增益（SRG）检测。如果斯托克斯光束被调制，在斯托克斯光束开启的情况下，SRS过程会引起泵浦光束的轻微下降。在检测器上，斯托克斯光束被阻断，只有泵浦光束被检测到。这被称为刺激性拉曼损失（SRL）检测。对于本应用说明中提出的使用案例，由于光电探测器针对泵的波长进行了优化，因此实施了SRL方案。
SRS的产生需要两个超快的激光脉冲在样品上重叠，包括空间和时间上的重叠。为了获得稳定的时间重叠，今天的SRS显微镜通常使用一个Ti:Sapphire激光器来产生泵浦和斯托克斯光束。皮秒和飞秒激光器都可用于SRS测量。皮秒激光器提供更精细的光谱轮廓。不需要额外的光学器件就可以实现高光谱分辨率。与自发拉曼不同的是，所有的拉曼位移都可以用单色激光器同时测量，而刺激拉曼需要调谐波长来测量更多的光谱点，而且在获取光谱图像时，调谐激光波长会限制测量的速率。另一方面，飞秒激光器本身具有宽广的光谱。一种叫做 "光谱聚焦 "的技术可以用来快速调整泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。可以在更短的时间内获得光谱图像。然而，这种方法也大大增加了系统的光学复杂性。一对衍射光栅或高折射率材料（如SF57玻璃棒）需要被添加到光束路径中，而且光谱范围是有限的。关于光谱聚焦方法的详细解释可以在最近的一份出版物中找到。
简而言之，如果一次只对单个拉曼位移感兴趣，皮秒激光器的设置要简单得多。飞秒激光器是快速获取高光谱图像的首选，其代价是系统的复杂性。Moku:Lab LIA可以与皮秒和飞秒激光器配对。在本应用说明中介绍的使用案例中，飞秒激光器（Spectra-physics Mai Tai）与SF57玻璃棒一起用于光谱聚焦。
泵和斯托克斯光束通常由声光调制器（AOM）或电光调制器（EOM）进行调制。调制频率通常在MHz范围内。这有助于减少光热膨胀产生的背景，提高图像采集速度。在本应用说明中，泵浦光束被AOM调制在2MHz左右。
为了使泵浦和斯托克斯光束在时间上保持一致，一个电动延迟台被用来调整其中一个或两个光束路径的长度。对于带有光谱聚焦的飞秒SRS，延迟台也被用来微调泵浦和斯托克斯光束之间的能量差。
像大多数其他非线性光学显微镜一样，光束扫描方法通常用于CARS和SRS图像的采集。一对振镜-振镜或振镜-共振扫描头被放置在物镜前。在本案例中，使用了一对振镜（GVS 102, Thorlabs）。
在扫描头之后，光束被引导到物镜上，在样品上形成一个紧密聚焦的点。为了建立相干拉曼散射的相位匹配条件，最好使用高数值孔径（NA）的水浸或油浸物镜。然后，光在前向被收集并重新聚焦到光电探测器上。为了确保收集效率，建议使用油浸式物镜。在本案例中，使用了一个60X 1.2 NA的水浸式物镜（UPLSASP 60XW，奥林巴斯）。
一旦光线被聚光器收集，在经过光学过滤器阻挡调制光束后，它就被重新聚焦到光电二极管上。来自光电二极管的信号然后被送到锁相放大器（根据光电二极管的配置，可能需要一个前置放大器/跨阻抗放大器）。锁相放大器将信号与本地振荡器混合，并将调制频率的交流信号转换为直流输出。然后，它被送到数据采集系统，形成图像。在这个应用中，Hamamatsu S3994-01与一个自制的跨阻抗放大器配对使用，用于检测光学过滤器后的剩余光线。然后，信号被送到Moku:Lab的LIA进行交流信号的放大和对话。输入是用外部（PLL）模式解调的。在混频器之后使用了一个7μs的二阶低通滤波器。解调后的信号经过10dB增益后被送到模拟输出。LIA的输出被NI DAQ系统数字化，图像由一个自制的NI虚拟仪器生成。
为了测试Moku:Lab的LIA性能，将一滴二甲亚砜（DMSO）夹在两片盖玻片之间。然后用SRS显微镜对液滴的边缘进行成像。在扫描头之前，激光器被调谐为798纳米泵浦（30毫瓦）和1040纳米斯托克斯（150毫瓦）。在整个光谱范围内，总共获得了100张图像。LIA的时间常数被设定为7μs。图4显示了液滴边缘的X-Y剖面图，右边是Z剖面图（拉曼光谱）。可以清楚地观察到由C-H键振动共振引起的两个主要峰值。
为了获取图像的信噪比（SNR），使用最亮的图像（2930 cm-1附近）。信噪比是由液滴区10乘10方框的平均强度超过背景区10乘10方框的标准偏差来计算的。观察到的信噪比为1100。
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