荧光寿命成像显微镜(FLIM)是一种鉴别荧光团独特分子环境的有力技术。FLIM测量荧光团在发射光子之前处于激发态的时间，并检测荧光团的分子变化，这些变化单独用光谱技术是看不出来的。FLIM对多种生物医学过程敏感，包括疾病进展和药物疗效。
荧光的产生与荧光寿命检测原理
当处于基态的分子(图1中的S0表示)吸收的光能量等于或大于较高能级的光(S1;S2;:::;Sn)，电子在短时间内被激发到更高的能级。电子将经历振动弛豫到激发态的最低振动水平(记为S1)，这是一种称为内转换的非辐射过程。从S1电子态，分子通过辐射或非辐射过程回到基态。图1表示了在这些能级中发生的不同发光现象。
荧光是分子(荧光团)通过发射可检测的光子(时间尺度为
)衰减到基态的辐射过程。荧光发射发生在激发电子能级最低的位置(S1)。这种来自最低激发电子能级的强制发射确保了发射光谱保持不变，并且与激发波长无关。由于振动弛豫和内部转换中的能量损失，发射的荧光光子的能量较低(即发射发生在比激发更长的波长)。这种发射波长的位移称为斯托克斯位移。另一个主要发光过程，磷光，通过被称为系统间交叉(ISC)的过程发生在激发时电子能量跃迁到三元态能级(T1;T2;:::;Tn)。三重态的电子具有平行自旋，这些电子跃迁是“自旋禁止的”，通过发射一个磷光光子或ISC反转和发射一个延迟的荧光光子，导致向地能级的缓慢跃迁。磷光的发生时间从毫秒到数百秒不等。图1所示的Jablonski图简洁地说明了这些过程。
图1
分子的量子产率被定义为发射的光子与吸收的光子之比。常见荧光化合物的量子产率包括荧光素的80%，eGFP的60%，色氨酸的6%，还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的2%。分子的这种发射效率取决于(1)它相对于入射电磁波电场方向的空间方向(极化)，(2)吸收入射光子能量可用的电子能级(吸收光谱)，(3)振动能级重排的效率(荧光寿命)，(4)弛张回到基态电子能级(斯托克斯位移)，(5)基态(发射光谱)内振动能级的总体。荧光团由吸收光谱、荧光寿命、斯托克斯位移和发射光谱表征。
按照惯例，荧光寿命τ定义为荧光团处于激发态的平均时间。在此区间内，强度I（t）减小到1/e或其原始值的36.8%。t时刻的衰变强度由样本中所有物种i的一级动力学方程求和得到。
其中α是指前因子或指数函数的幅值。多指数混合种的平均寿命(τm)是各种寿命(τi)与各种贡献(αi)的加权之和。
另外，在t时刻被激发的分子数为
其中n（t）是t时刻处于激发态的分子数。
在荧光寿命的检测中，样品由一个短的激励脉冲激发，衰减由光子到达时间计算，光子被分组成直方图，或通过时间门控检测或脉冲采样技术。如果有多个荧光种存在，所有的种都被总结为一个单一的直方图。在频域方法中，每个光子都用它相对于激发光子的相位延迟来表示，这类似于到达时间直方图。对于多物种，在傅里叶空间中分析这种相位分布，提取分离多物种的调制解调参数。时域和频域都在不同的FLIM场景中提供了独特的优势和挑战，包括低光子预算成像，高动态范围成像，或高时间分辨率成像。
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