活生物体的生物过程成像需要具有三维高时空分辨率率的光学显微成像手段。如，在体脑成像需要亚微米空间分辨率区分突触(synapses)、神经元用来通讯和协调活动(communicate and coordinate activity)的特定亚细胞结构等，以及亚秒级时间分辨率来追踪神经元活动。尽管在一个体积内(如跨同一神经元的树突)研究突触活动是最常用的手段，但是仍然缺乏能以高时空分辨率对突触进行三维成像的方法。
自适应光学+贝塞尔光束+双光子荧光实现高时空分辨率在体体积成像
技术背景：
在先进的在体成像技术中，双光子荧光显微镜(two-photon fluorescence microscopy, 2PFM)是对大脑这样的不透明组织进行成像的最流行技术，其微小的双光子吸收截面将荧光产生限制在显微镜物镜的聚焦体积内。为了对样品中的单个光学截面进行成像，2PFM在二维扫描激发焦点并记录每个位置的荧光信号，衍射极限焦点提供最亮的荧光信号以及最高的空间分辨率。然而，只有通过自适应光学(adaptive optics, AO)才能维持在体深度的高空间分辨率，自适应光学可以测量和校正成像光穿过光异质样品时在波前积累的光学像差。AO与2PFM相结合，将校正的相位模式应用于物镜后瞳平面(back pupil plane)的激发波前，可以实现衍射极限性能，并且可以在大脑表面以下数百微米处解析突触。
大脑的在体成像也需要高时间分辨率，对于大脑内的功能成像，需要亚秒级的时间分辨率来跟上神经元活动的产生和传播。传统的2PFM通过在三个维度上依序扫描其激发焦点来实现三维成像，这导致体积成像速率远低于其二维帧率。使用贝塞尔光束作为激发焦点的体积2PFM成像，可以对焦点区域实现轴向拉长但是横向受限，从而能够同时对由二维扫描区域和贝塞尔焦点的轴向长度定义的体积内的结构进行成像，将二维帧速率转换为三维体积速率。
然而，就像通过完全照射物镜back pupil形成的传统双光子激发焦点一样，通过用环形pattern照射pupil形成的贝塞尔焦点也会经历样品引起的像差，在传播通过像差媒介后降低光束轮廓。贝塞尔聚焦质量如何受光学像差影响，以及如何校正这些像差以在深度上恢复衍射极限性能仍然还知之甚少。
基于此，美国加州大学伯克利分校的Wei Chen(一作)和Na ji(通讯)提出一种有效的自适应光学方法，可以校正物镜焦平面上贝塞尔焦点的失真波前，并恢复衍射极限成像性能，从而实现在体体积成像的高时空分辨率。作者将AO Bessel聚焦扫描2PFM应用于深度上达500um的斑马鱼幼苗和小鼠大脑体积成像，证明了在体突触结构和功能测量的灵敏度和分辨率的显著提升，从而能以高精度对突触钙和谷氨酸活性进行体积测量(包括同时记录小鼠皮层中顶端和基底树突棘的谷氨酸活性)。
(1)从理论上和实验上表征了不同像差模式如何影响2PFM中贝塞尔焦点的质量。
(2)通过在物镜焦平面而不是传统AO中的光瞳(pupil)平面控制激发波前，开发了一种高效且有效的像差校正方法，从而能够恢复衍射极限成像性能。
图1、高效像差校正用于贝塞尔焦点扫描2PFM
图2、像差校正恢复衍射极限分辨率用于斑马鱼幼苗在体体积成像
通过贝塞尔聚焦扫描在2 Hz的体积速率下以及无AO和有AO的情况下对体积(128×100×60 μm3，从Z=190µm到Z=250µm below pia)中GCaMP6s+树突和树突棘的自发钙瞬变进行成像。
清醒小鼠在体视觉皮层神经元基底树突棘中视觉诱发谷氨酸信号(iGluSnFR-A184S)的体积成像。通过贝塞尔聚焦扫描在无AO和有AO(128×128×60μm3，从Z=120μm到Z=180µm below pia)的情况对比。视觉刺激：伪随机序列中的12个全场漂移光栅(0° 至330°，增量为30°）。对每个刺激重复20次试验，视频为试验平均结果。
附录：
AO高斯和AO贝塞尔焦点扫描2PFM光路
(a)位于激发激光器和2PFM之间的贝塞尔模块照片。原始的高斯路径(白虚线)和贝塞尔路径可以通过翻转反射镜切换(b)贝塞尔模块零件清单
参考文献：Chen, W., Natan, R.G., Yang, Y. et al. In vivo volumetric imaging of calcium and glutamate activity at synapses with high spatiotemporal resolution. Nat Commun 12, 6630 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26965-7
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