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DMD在双光子激发显微镜中应用时间聚焦是一种高度并行的激光激发技术,广泛应用于细胞动态成像、光遗传学和微制造等领域。虽然时间聚焦多光子激发显微镜能在宽视场成像,但在轴向分辨率方面传统点扫描多光子显微技术更占优势。一种改进方式是采用线扫描的工作方式,将光线聚焦到线中来对激发平面进行图形化,提高轴向分辨率。而使用DMD可以有效实现对光的快速空间调制,在激发面形成动态图样。同时由于DMD的图样可编程性,可以控制线宽,也可以同时照明多条线,并快速扫过样品。这有利于实际实验中平衡照明区域和轴向分辨率的不同需求。上图为实验装置示意图。激光束经过反射光栅衍射,通过两个凸透镜将经过衍射的光束投射在DMD的微镜 ...
绕锥形光纤的双光子激发点被扫描。产生的荧光可通过未脱膜的PMT(显微镜PMT)和补片光纤远端的光纤PMT检测。Ls,透镜系统;F1和F2,带通荧光滤波器;L2,镜头。c,在PBS-荧光素溶液中,随着NAs的增加锥形光纤的典型ξT(x,y)集合字段(每个字段归一化到其zui大值);比例尺,500µm。d,比较在pbs -荧光素溶液中扫描的双光子荧光光斑采集的光子数(像素停留时间,3.2µs),内嵌扁平切割光纤与NA = 0.66, ψ = ~4°的锥形光纤;FF图中的等值线显示锥形光纤收集到的zui大光子数。比例尺,500µm。e, NA-0.66 锥形光纤在pbs -荧光素溶液中的光子收集的等 ...
峰值光强超过双光子激发的阈值。这提供了固有的3D分辨率,并消除了对有损耗的共聚焦孔的需要。然而,这两种技术都受到实际成像中的需要取舍的负面影响,例如以捕获代谢过程所需的帧率在组织内部进行更深层次成像的能力。此外,由于显微镜光学器件的像差,或者更隐蔽地,由样品组织本身的光学性质,分辨率可能会受到负面影响。Sandström解释说,将声光偏转器(AOD)运用在共聚焦显微镜中,代替传统的振镜扫描激光来解决这些限制。在声光结构中,声波被应用于某些类型的光学透明材料,如晶体,引起材料折射率的变化。这种折射率的变化使穿过材料的光发生偏转。通过应用时变声波,偏转角度可以迅速改变,允许快速和精确的扫描激光束。 ...
要求更高,如双光子激发荧光和二次谐波产生(SHG)显微镜,需要一个单一的激发光束。早期大多数CARS显微镜使用了两个独立的电子同步皮秒Ti:sapphire振荡器,导致系统非常庞大和复杂。这很快就被目前单频CRS显微镜中的“金标准”所取代,该标准由皮秒Nd:YVO4振荡器同步泵浦光学参数振荡器(OPO)组成,这种激光系统的复杂性促使人们进行了密集的研究,旨在大幅减少占地面积和价格,同时提高可靠性,其主要是通过光纤格式架构。一类系统是基于飞秒Er:光纤振荡器在1550 nm,播种一对掺铒光纤放大器,其中一个是高度非线性光纤。通过对厚SHG晶体中的两个脉冲序列进行频率倍增和频谱压缩,可以合成775 ...
多个具有足够双光子激发的功率的光束,以便更快地激发一个完整的成像场并产生更好的信噪比。我们的系统是从双光子显微镜的早期版本发展而来的,在该系统中,我们使用DOE将激光束多重化,将谷氨酸释放到样品上(Nikolenko等人,2007年)。我们的装置包括一个定制的双光子扫描显微镜,飞秒激光作为激发源,一个传统的振镜扫描系统,一个PMT或CCD相机作为探测器(见“材料和方法”部分;我们测试了几种线性DOEs,创建了5、11、16和32个波束的线性阵列,并探索了两种通用的扫描策略,将波束水平或垂直定位,尽管我们也探索了中间位置,如下所示(图2)。实际的扫描扫描总是水平方向,每个波束都有足够的功率诱导样 ...
聚焦显微镜和双光子激发技术一种新技术。为了不损伤细胞,双光子显微镜使用了高能量锁模脉冲激光器,因该激光器具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲宽度只有100飞秒,而其频率可以达到80至100兆赫。不仅如此,双光子显微镜检测效率高、易穿透标本、对细胞毒性小、只在焦平面上才有光漂白和光毒性,这也使得显微镜在观察厚标本、活细胞、定点光漂白实验上起着积极的作用。随着科学技术的发展和社会的进步,人们对仪器设备的各项性能提出了更高的要求,科技工作者也投入于研发新产品和新技术。在国家自然科学基金委重大科研仪器研制专项“超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统”的支持下,由北京大学分子医学研究所牵头,联合 ...
成像技术介绍双光子激发显微镜(Two-photon excitation microscopy)是一种荧光成像技术,可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。它不同于传统的荧光显微镜,其中激发波长短于发射波长,因为两个激发光子的波长长于所得发射光的波长。双光子激发显微通常使用近红外(1064nm)激发光,可以激发荧光染料。使用近红外的好处是可最大限度地减少组织中的散射。由于多光子吸收,同时能够减小背景噪声。这两种效果都会导致这些显微镜的穿透深度增加。基于荧光指示剂的钙成像提供了一种监测动作电位的光学方法,并被系统的用于补充微电极记录,测量体内的神经元活动。这种方法为重建小型模式生物体整个大脑中的神 ...
聚焦激发光的双光子激发下,横向空间分辨率可以用对物体区域中强度分布的高斯拟合来很好地描述。空间分辨率为照明点扩散函数的平方的最大强度的1∕e半径,定义为:其中,λ为照明光的波长,NA为物镜的数值孔径。我们将成像系统的横向空间分辨率定义为IPSF2的1∕e2点的全宽度:求解NA,在小于0.7的假设下,我们发现0.65NA的物镜足以在1040nm照明光下提供约1μm的空间分辨率。因此,我们选择一个40×∕0.65NA的物镜。基于这个物镜,我们现在选择能够提供所需 FOV 的扫描透镜和套筒透镜Tube Lens。实际上,这相当于选择具有适当 f 数 (f ∕#) 的 Tube Lens。套筒透镜的孔 ...
,SHG)、双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence,TPEF)的多模非线性显微镜,可以实现离体生物样本的分子组成和形态信息的高灵敏和高特异性无创无标记检测(区分恶性组织和良性0组织)。当前不足:完成多模非线性显微镜有以下挑战:(1) 光纤耦合的高功率超快激光源(具有风冷、坚固、紧凑、便携特性);(2) 在长距离上的使用光纤进行超短脉冲激光传输和信号采集,要求具有低损耗;(3) 置于内窥镜头端部成像用的超紧凑、快速、精确的扫描仪;(4) 高性能小型化高数值孔径的内窥显微物镜,在双波段进行校正(因为相干拉曼成像使用两个光谱不一样的激光束)。文章创新点:基于此 ...
现40kHz双光子激发体积的全息成形。使用3D-CASH,以40kHz的频率从神经元进行串行采样,3D位置可自由选择。通过使用覆盖细胞体及其预期位移场的尺寸优化的激发光模式瞄准每个神经元,消除运动伪影。从清醒小鼠视觉皮层中的GCaMP6f记录推断的尖峰率跟踪移动条刺激的相位,与层间神经元对相比,内部之间具有更高的尖峰相关性。3D-CASH提供了对3D微回路中体内神经元活动的毫秒相关结构的访问。图1、3DScope的原理图2、激发光的holographic patterning图3、用于清醒小鼠稳定RAMP记录的全息照明附录:光学系统参考文献:Akemann, W., Wolf, S., Vil ...
l形成的传统双光子激发焦点一样,通过用环形pattern照射pupil形成的贝塞尔焦点也会经历样品引起的像差,在传播通过像差媒介后降低光束轮廓。贝塞尔聚焦质量如何受光学像差影响,以及如何校正这些像差以在深度上恢复衍射极限性能仍然还知之甚少。技术要点:基于此,美国加州大学伯克利分校的Wei Chen(一作)和Na ji(通讯)提出一种有效的自适应光学方法,可以校正物镜焦平面上贝塞尔焦点的失真波前,并恢复衍射极限成像性能,从而实现在体体积成像的高时空分辨率。作者将AO Bessel聚焦扫描2PFM应用于深度上达500um的斑马鱼幼苗和小鼠大脑体积成像,证明了在体突触结构和功能测量的灵敏度和分辨率的 ...
光损伤。产生双光子激发荧光和二次谐波生成等非线性过程信号的强度正比于激光的强度DOI:https://doi.org/10.1038/nphoton.an.2010.2本文章经光学前沿授权转载,商业转载请联系获得授权。关于昊量光电:上海昊量光电设备有限公司是目前国内知名光电产品专业代理商,也是近年来发展迅速的光电产品代理企业。除了拥有一批专业技术销售工程师之外,还有拥有一支强大技术支持队伍。我们的技术支持团队可以为客户提供完整的设备安装,培训,硬件开发,软件开发,系统集成等工作。秉承诚信、高效、创新、共赢的核心价值观,昊量光电坚持以诚信为基石,凭借高效的运营机制和勇于创新的探索精神为我们的客户 ...
新审视了使用双光子激发荧光、三次谐波生成、偏振三次谐波生成等多光子显微成像的折射率不匹配介质之间垂直界面的常见几何形状,表明ASR/Green模型无法重现实验观察结果,因为它忽略了近焦处的场失真,相比之下,基于FDTD的方法准确地解释了实验观察到的伪影。对相干和偏振分辨图像的解释具有重要意义。应用场景:多光子显微成像定量图像描述。DOI:https://doi.org/10.1364/OPTICA.421257本文章经光学前沿授权转载,商业转载请联系获得授权。关于昊量光电:上海昊量光电设备有限公司是目前国内知名光电产品专业代理商,也是近年来发展迅速的光电产品代理企业。除了拥有一批专业技术销售工 ...
用飞秒激光器双光子激发荧光(TPEF)显微镜,也称为双光子显微镜,是对活体组织深层三维成像的首选方法。深度成像是TPEF显微镜固有的优势,它使用了更长的激发波长(通常是近红外波段),因而其带来的散射比传统共聚焦显微镜中所使用的较短的可见波长更少。更长的波长同时也减少了来自散射光的背景照明,并增加了在更高深度处的对比度。目前,用TPEF显微镜可以获得1mm深度的体内大脑图像。在荧光显微镜中,当两个独立的光子被一种介质同时吸收时,就会发生双光子激发。这需要两个合适能量的光子在这样的介质上时间和空间上同时重合;通常来说这不需要非常大的激发光子通量,当然光子通量越大, 双光子同时被吸收的概率就越大。在 ...
子激发相比,双光子激发具有更好的限制,因为由两个光子同时激发的可能性与光强度的平方成正比。因此,双光子激发以焦点距离的四次幂衰减[8]。然而,这种低激发的可能性使得操作模式对改变焦点的PSF的像差敏感。为了确保在大体积上的一致激发,校正显微镜中SLM和其余光学元件的像差是很重要的。 许多用于表征和校正像差的算法都基于Zernike多项式。然而,对圆形孔径的依赖不适用于描述正方形或矩形阵列的像差。已经开发了基于SLM的干涉子孔径的替代策略[9],以确保SLM的有效区域上的像差可以被校正到λ/ 40或更好。如图7所示,由于使用了制造工艺,MLO SLM的本身的波前像差很低。(a)原始的1920 ...
子激发相比,双光子激发具有更好的限制,因为由两个光子同时激发的可能性与光强度的平方成正比。因此,双光子激发以焦点距离的四次幂衰减[8]。然而,这种低激发的可能性使得操作模式对改变焦点的PSF的像差敏感。为了确保在大体积上的一致激发,校正显微镜中SLM和其余光学元件的像差是很重要的。许多用于表征和校正像差的算法都基于Zernike多项式。然而,对圆形孔径的依赖不适用于描述正方形或矩形阵列的像差。已经开发了基于SLM的干涉子孔径的替代策略[9],以确保SLM的有效区域上的像差可以被校正到λ/ 40或更好。如图7所示,由于使用了制造工艺,MLO SLM的本地波前像差很低。残留误差被去除以确保神经元激 ...
聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。生物组织中含有很多内源荧光团,分布于皮肤组织的NAD(P)H,FAD,胶原蛋白,弹性蛋白,黑色素等皮肤组分中,在适当的飞秒激光激发下可产生稳定的双光子荧光信号。此外,飞秒激光还会引起皮肤组织中的非对称结构产生二次谐波信号,因此通过合理设置收集通道的滤光片,即可在同一台光学显微镜下,同时获得双光子自发荧光图像和二次谐波图像,实现双模态信号检测。这种方法在皮肤衰老检测,皮肤疾病检测方面有着巨大的应用潜力。基于双光子显微成像原理,本产品根据预期用途实现了对体表上皮细胞及组织的自发荧光成像和二次谐波成像。双光子自发荧光(2PEF)指基态荧光分子或原子吸收两个光子 ...
移荧光标记的双光子激发光谱重叠,包括eGFP、mRFP和dred。这大大超过了传统飞秒激光器(包括宽调谐激光器和单线飞秒光纤激光器)可以同时激发的荧光标记的范围。宽带飞秒光纤激光器SCH提供了一种高度灵活的解决方案,增强了可以在样品上同时成像的特性,这对体内和体外显微镜特别重要。 1、 利用宽带飞秒光纤激光器Cyclone激光激发的花粉自荧光成像显示花粉粒在不同光谱通道同时激发,图像质量良好。2、 不仅光谱更宽,而且宽带飞秒光纤激光器SCH还提供更短的脉冲。结合一个专用的色散预补偿器,实现到达显微镜样品平面的脉宽达15-20fs量级。这实现了一个非凡的峰值功率和样品平面上无与伦比的光子通量,达 ...
为钙指示剂的双光子激发提供更高的亮度和对比度,例如红色视蛋白(RCaMP,tdTomato等)。此更高功率的ALCOR始终为GDD预补偿(无论是负还是正)提供宽泛的可调范围。可以选择为激光器配备XSight完全集成的模块,以通过GUI或TTL信号进行精细、快速的模拟功率调制。SPARK LASERS用ALCOR引领市场,通过提供用于显微镜的单波长、高性能、免维护、具有高性价比的激光器来满足市场需求。ALCOR是新一代超高速飞秒光纤激光器,具有卓越的功能:超紧凑激光头设计,可快速轻松地安装在显微镜系统上平均输出功率可达5W全天候运行的行业级可靠性,免维护创新的空气冷却;没有振动,无需水冷高质量的 ...
性成像过程(双光子激发)的效率就越高,成功的实验所需的激发能量就越少。在确定样品的显示度时,这种光束特性也是必要的。它保证了图像的优化和正确的强度水平估计,因为不正确的值甚至可能导致样本损坏。双光子显微自相关仪可以覆盖各种波长范围,也可以通过使用3组可互换的光电探测器和光学器件组合这些波长范围。还可以根据需要覆盖两个单独的范围。输入脉冲持续时间从20飞秒到12皮秒不等,便于不同激光系统的监测。该设备具有USB接口,可以很容易地与装有Windows操作系统的个人电脑连接。该软件由该设备提供,包括几个有用的工具。所获得的脉冲持续时间数据可以可视化、存储或导出到.txt或.dat文件中。计算并实时显 ...
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